Om effectiefmuggen bestrijdenOm de incidentie van de ziekten die ze overdragen te verminderen, zijn strategische, duurzame en milieuvriendelijke alternatieven voor chemische bestrijdingsmiddelen nodig. We hebben zaadmeel van bepaalde Brassicaceae (familie Brassica) geëvalueerd als bron van plantaardige isothiocyanaten, geproduceerd door enzymatische hydrolyse van biologisch inactieve glucosinolaten, voor gebruik bij de bestrijding van de Egyptische Aedes-mug (L., 1762). Vijf ontvette zaadmeel (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 en Thlaspi arvense – drie hoofdtypen van thermische inactivatie en enzymatische afbraak). Chemische producten. Om de toxiciteit (LC50) van allylisothiocyanaat, benzylisothiocyanaat en 4-hydroxybenzylisothiocyanaat voor Aedes aegypti-larven te bepalen bij een blootstelling van 24 uur = 0,04 g/120 ml dH2O). LC50-waarden voor mosterd, witte mosterd en heermoes. De LC50-waarden van zaadmeel waren respectievelijk 0,05, 0,08 en 0,05, vergeleken met allylisothiocyanaat (LC50 = 19,35 ppm) en 4-hydroxybenzylisothiocyanaat (LC50 = 55,41 ppm). 4-Hydroxybenzylisothiocyanaat bleek 24 uur na behandeling giftiger voor larven dan 0,1 g/120 ml dH2O. Deze resultaten komen overeen met de productie van alfalfazaadmeel. De hogere werkzaamheid van benzylesters komt overeen met de berekende LC50-waarden. Het gebruik van zaadmeel kan een effectieve methode zijn voor muggenbestrijding. De effectiviteit van kruisbloemzaadpoeder en de belangrijkste chemische componenten ervan tegen muggenlarven wordt aangetoond, en laat zien hoe de natuurlijke verbindingen in kruisbloemzaadpoeder een veelbelovend, milieuvriendelijk larvicide kunnen vormen voor muggenbestrijding.
Door Aedes-muggen overgedragen ziekten blijven een groot wereldwijd probleem voor de volksgezondheid. De incidentie van door muggen overgedragen ziekten verspreidt zich geografisch1,2,3 en duikt steeds opnieuw op, wat leidt tot uitbraken van ernstige ziekten4,5,6,7. De verspreiding van ziekten onder mensen en dieren (bijvoorbeeld chikungunya, dengue, Rift Valley-koorts, gele koorts en het Zika-virus) is ongekend. Alleen al dengue brengt ongeveer 3,6 miljard mensen in de tropen in gevaar, met naar schatting 390 miljoen infecties per jaar, resulterend in 6.100 tot 24.300 sterfgevallen per jaar8. De herverschijning en uitbraak van het Zika-virus in Zuid-Amerika heeft wereldwijde aandacht getrokken vanwege de hersenschade die het veroorzaakt bij kinderen die geboren worden uit geïnfecteerde vrouwen2. Kremer et al.3 voorspellen dat het geografische verspreidingsgebied van Aedes-muggen zich zal blijven uitbreiden en dat in 2050 de helft van de wereldbevolking risico loopt op infectie door door muggen overgedragen arbovirussen.
Met uitzondering van de recent ontwikkelde vaccins tegen dengue en gele koorts, zijn er nog geen vaccins ontwikkeld tegen de meeste door muggen overgedragen ziekten9,10,11. Vaccins zijn weliswaar in beperkte hoeveelheden beschikbaar en worden alleen gebruikt in klinische onderzoeken. De bestrijding van muggen met synthetische insecticiden is een belangrijke strategie geweest om de verspreiding van door muggen overgedragen ziekten tegen te gaan12,13. Hoewel synthetische pesticiden effectief zijn in het doden van muggen, heeft het voortdurende gebruik ervan negatieve gevolgen voor niet-doelorganismen en vervuilt het het milieu14,15,16. Nog alarmerender is de trend van toenemende resistentie van muggen tegen chemische insecticiden17,18,19. Deze problemen met pesticiden hebben de zoektocht naar effectieve en milieuvriendelijke alternatieven voor de bestrijding van ziektevectoren versneld.
Er zijn diverse planten ontwikkeld als bronnen van fytopesticiden voor de bestrijding van plagen20,21. Plantaardige stoffen zijn over het algemeen milieuvriendelijk omdat ze biologisch afbreekbaar zijn en een lage of verwaarloosbare toxiciteit hebben voor niet-doelorganismen zoals zoogdieren, vissen en amfibieën20,22. Kruidenpreparaten staan erom bekend dat ze een verscheidenheid aan bioactieve stoffen produceren met verschillende werkingsmechanismen om verschillende levensstadia van muggen effectief te bestrijden23,24,25,26. Plantaardige stoffen zoals etherische oliën en andere actieve plantaardige ingrediënten hebben de aandacht getrokken en de weg vrijgemaakt voor innovatieve middelen om muggen als vectoren te bestrijden. Etherische oliën, monoterpenen en sesquiterpenen werken als afweermiddelen, voedselremmers en oviciden27,28,29,30,31,32,33. Veel plantaardige oliën veroorzaken de dood van muggenlarven, poppen en volwassen muggen34,35,36 en beïnvloeden het zenuwstelsel, de ademhaling, het endocriene systeem en andere belangrijke systemen van insecten37.
Recente studies hebben inzicht gegeven in het potentiële gebruik van mosterdplanten en hun zaden als bron van bioactieve stoffen. Mosterdzaadmeel is getest als biofumigant38,39,40,41 en gebruikt als bodemverbeteraar voor onkruidbestrijding42,43,44 en de bestrijding van bodemgebonden plantpathogenen45,46,47,48,49,50, plantenvoeding, nematoden41,51, 52, 53, 54 en plagen55, 56, 57, 58, 59, 60. De fungicide werking van deze zaadpoeders wordt toegeschreven aan plantbeschermende stoffen, isothiocyanaten genaamd38,42,60. In planten worden deze beschermende stoffen in plantencellen opgeslagen in de vorm van niet-bioactieve glucosinolaten. Wanneer planten echter beschadigd raken door insectenvraat of een pathogene infectie, worden glucosinolaten door myrosinase gehydrolyseerd tot bioactieve isothiocyanaten55,61. Isothiocyanaten zijn vluchtige verbindingen waarvan bekend is dat ze een breed spectrum aan antimicrobiële en insecticide activiteit bezitten, en hun structuur, biologische activiteit en gehalte variëren sterk tussen Brassicaceae-soorten42,59,62,63.
Hoewel isothiocyanaten afkomstig van mosterdzaadmeel bekend staan om hun insecticide werking, ontbreken gegevens over hun biologische activiteit tegen medisch belangrijke geleedpotige vectoren. In deze studie onderzochten we de larvicide werking van vier ontvette zaadpoeders tegen Aedes-muggenlarven. Het doel van de studie was om hun potentiële gebruik als milieuvriendelijke biopesticiden voor muggenbestrijding te evalueren. Drie belangrijke chemische componenten van het zaadmeel, allylisothiocyanaat (AITC), benzylisothiocyanaat (BITC) en 4-hydroxybenzylisothiocyanaat (4-HBITC), werden ook getest op hun biologische activiteit tegen muggenlarven. Dit is het eerste onderzoek waarin de effectiviteit van vier koolzaadpoeders en hun belangrijkste chemische componenten tegen muggenlarven wordt geëvalueerd.
Laboratoriumkolonies van Aedes aegypti (Rockefeller-stam) werden gehouden bij 26 °C, 70% relatieve luchtvochtigheid (RV) en een licht-donkercyclus van 10:14 uur. Bevruchte vrouwtjes werden gehuisvest in plastic kooien (hoogte 11 cm en diameter 9,5 cm) en gevoed via een flesvoedingssysteem met gecitrateerd runderbloed (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, VS). Het bloedvoeden gebeurde zoals gebruikelijk met behulp van een membraan-multiglazen voederbak (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, VS) aangesloten op een circulatiesysteem met een waterbad (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, VS) met temperatuurregeling op 37 °C. Een folie van Parafilm M werd over de bodem van elke glazen voederbak (oppervlakte 154 mm²) gespannen. Elke voederbak werd vervolgens op het rooster geplaatst dat de kooi met het bevruchte vrouwtje bedekte. Ongeveer 350–400 μl runderbloed werd met een Pasteurpipet (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, VS) aan een glazen voedertrechter toegevoegd en de volwassen wormen mochten minstens een uur uitlekken. Zwangere vrouwtjes kregen vervolgens een 10% sucroseoplossing en mochten eieren leggen op vochtig filtreerpapier in individuele, ultraheldere soufflébakjes (1,25 fl oz, Dart Container Corp., Mason, MI, VS). Plaats het filtreerpapier met de eieren in een luchtdichte zak (SC Johnsons, Racine, WI) en bewaar deze bij 26 °C. De eieren werden uitgebroed en ongeveer 200–250 larven werden gekweekt in plastic bakjes gevuld met een mengsel van konijnenvoer (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, VS) en leverpoeder (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, VS). en visfilet (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Duitsland) in een verhouding van 2:1:1. Voor onze bioassays gebruikten we larven in het late derde stadium.
Het in dit onderzoek gebruikte plantmateriaal is afkomstig van de volgende commerciële en overheidsbronnen: Brassica juncea (bruine mosterd - Pacific Gold) en Brassica juncea (witte mosterd - Ida Gold) van de Pacific Northwest Farmers' Cooperative, Washington State, VS; (tuinkers) van Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, VS en Thlaspi arvense (veldkers - Elisabeth) van USDA-ARS, Peoria, IL, VS. Geen van de in het onderzoek gebruikte zaden is behandeld met pesticiden. Al het zaadmateriaal is verwerkt en gebruikt in dit onderzoek in overeenstemming met lokale en nationale regelgeving en conform alle relevante lokale, staats- en nationale voorschriften. In dit onderzoek zijn geen genetisch gemodificeerde plantenrassen onderzocht.
De zaden van Brassica juncea (PG), alfalfa (Ls), witte mosterd (IG) en Thlaspi arvense (DFP) werden fijngemalen tot poeder met behulp van een Retsch ZM200 ultracentrifugale molen (Retsch, Haan, Duitsland) uitgerust met een zeef van 0,75 mm en een roestvrijstalen rotor met 12 tanden en 10.000 tpm (Tabel 1). Het gemalen zaadpoeder werd overgebracht naar een papieren filterpatroon en ontvet met hexaan in een Soxhlet-apparaat gedurende 24 uur. Een submonster van het ontvette mosterdzaad werd gedurende 1 uur verhit tot 100 °C om myrosinase te denatureren en hydrolyse van glucosinolaten tot biologisch actieve isothiocyanaten te voorkomen. Verhit behandeld paardenstaartzaadpoeder (DFP-HT) werd gebruikt als negatieve controle door myrosinase te denatureren.
Het glucosinolaatgehalte van ontvette zaadmeel werd in drievoud bepaald met behulp van hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC) volgens een eerder gepubliceerd protocol 64. Kort gezegd werd 3 ml methanol toegevoegd aan een monster van 250 mg ontvet zaadpoeder. Elk monster werd 30 minuten gesoniceerd in een waterbad en vervolgens 16 uur in het donker bewaard bij 23 °C. Een aliquot van 1 ml van de organische laag werd vervolgens door een 0,45 μm filter gefilterd in een autosampler. Op een Shimadzu HPLC-systeem (twee LC 20AD-pompen; SIL 20A-autosampler; DGU 20As-ontgasser; SPD-20A UV-VIS-detector voor monitoring bij 237 nm; en CBM-20A-communicatiebusmodule) werd het glucosinolaatgehalte van het zaadmeel in drievoud bepaald. De analyse werd uitgevoerd met behulp van Shimadzu LC Solution software versie 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, VS). De kolom was een C18 Inertsil reversed-phase kolom (250 mm × 4,6 mm; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, VS). De initiële mobiele fase bestond uit 12% methanol/88% 0,01 M tetrabutylammoniumhydroxide in water (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) met een stroomsnelheid van 1 ml/min. Na injectie van 15 μl monster werden de initiële omstandigheden gedurende 20 minuten aangehouden, waarna de oplosmiddelverhouding werd aangepast naar 100% methanol. De totale analysetijd van het monster bedroeg 65 minuten. Een standaardcurve (op basis van nM/mAb) werd gegenereerd door seriële verdunningen van vers bereide sinapine-, glucosinolaat- en myrosine-standaarden (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) om het zwavelgehalte van ontvette zaadmeel te schatten. De glucosinolaatconcentraties in de monsters werden getest op een Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, VS) met behulp van de OpenLAB CDS ChemStation-versie (C.01.07 SR2 [255]), uitgerust met dezelfde kolom en met behulp van een eerder beschreven methode. De glucosinolaatconcentraties werden bepaald; ze zijn vergelijkbaar tussen HPLC-systemen.
Allylisothiocyanaat (94%, stabiel) en benzylisothiocyanaat (98%) werden gekocht bij Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS). 4-Hydroxybenzylisothiocyanaat werd gekocht bij ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, VS). Wanneer glucosinolaten enzymatisch gehydrolyseerd worden door myrosinase, vormen ze respectievelijk allylisothiocyanaat, benzylisothiocyanaat en 4-hydroxybenzylisothiocyanaat.
Laboratoriumbioassays werden uitgevoerd volgens de methode van Muturi et al. 32 met enkele aanpassingen. Vijf vetarme zaadvoeders werden in het onderzoek gebruikt: DFP, DFP-HT, IG, PG en Ls. Twintig larven werden in een wegwerpbeker van 400 ml (VWR International, LLC, Radnor, PA, VS) geplaatst, gevuld met 120 ml gedemineraliseerd water (dH2O). Zeven concentraties zaadmeel werden getest op toxiciteit voor muggenlarven: 0,01, 0,02, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1 en 0,12 g zaadmeel/120 ml dH2O voor respectievelijk DFP-zaadmeel, DFP-HT, IG en PG. Voorlopige bioassays wijzen erop dat ontvet Ls-zaadmeel giftiger is dan de vier andere geteste zaadmeelsoorten. Daarom hebben we de zeven behandelingsconcentraties van Ls-zaadmeel aangepast naar de volgende concentraties: 0,015, 0,025, 0,035, 0,045, 0,055, 0,065 en 0,075 g/120 ml dH2O.
Een onbehandelde controlegroep (dH20, geen zaadmeelsupplement) werd opgenomen om de normale insectensterfte onder testomstandigheden te beoordelen. Toxicologische bioassays voor elk zaadmeel omvatten drie replicaten in bekers met drie hellingen (20 larven in het late derde stadium per beker), voor een totaal van 108 buisjes. De behandelde containers werden bewaard bij kamertemperatuur (20-21 °C) en de larvensterfte werd geregistreerd gedurende 24 en 72 uur continue blootstelling aan de behandelingsconcentraties. Als het lichaam en de aanhangsels van de mug niet bewegen wanneer ze worden doorboord of aangeraakt met een dunne roestvrijstalen spatel, worden de muggenlarven als dood beschouwd. Dode larven blijven meestal roerloos liggen in een dorsale of ventrale positie op de bodem van de container of op het wateroppervlak. Het experiment werd drie keer herhaald op verschillende dagen met verschillende groepen larven, voor een totaal van 180 larven die aan elke behandelingsconcentratie werden blootgesteld.
De toxiciteit van AITC, BITC en 4-HBITC voor muggenlarven werd beoordeeld met dezelfde bioassayprocedure, maar met verschillende behandelingen. Bereid stamoplossingen van 100.000 ppm voor elke chemische stof door 100 µL van de stof toe te voegen aan 900 µL absolute ethanol in een centrifugebuisje van 2 ml en 30 seconden te schudden om grondig te mengen. De behandelingsconcentraties werden bepaald op basis van onze voorlopige bioassays, waaruit bleek dat BITC veel toxischer was dan AITC en 4-HBITC. Om de toxiciteit te bepalen, werden 5 concentraties BITC (1, 3, 6, 9 en 12 ppm), 7 concentraties AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 en 35 ppm) en 6 concentraties 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 en 35 ppm) gebruikt. 30, 45, 60, 75 en 90 ppm). De controlegroep werd geïnjecteerd met 108 μL absolute ethanol, wat overeenkomt met het maximale volume van de chemische behandeling. De bioassays werden herhaald zoals hierboven beschreven, waarbij in totaal 180 larven per behandelingsconcentratie werden blootgesteld. De larvensterfte werd geregistreerd voor elke concentratie van AITC, BITC en 4-HBITC na 24 uur continue blootstelling.
Probitanalyse van 65 dosisgerelateerde sterftegegevens werd uitgevoerd met behulp van Polo-software (Polo Plus, LeOra Software, versie 1.0) om de 50% letale concentratie (LC50), de 90% letale concentratie (LC90), de helling, de letale dosiscoëfficiënt en de 95% letale concentratie te berekenen op basis van betrouwbaarheidsintervallen voor letale dosisverhoudingen voor log-getransformeerde concentratie- en dosis-sterftecurven. De sterftegegevens zijn gebaseerd op gecombineerde replicagegevens van 180 larven die aan elke behandelingsconcentratie werden blootgesteld. Probabilistische analyses werden afzonderlijk uitgevoerd voor elk zaadmeel en elke chemische component. Op basis van het 95% betrouwbaarheidsinterval van de letale dosisverhouding werd de toxiciteit van zaadmeel en chemische bestanddelen voor muggenlarven als significant verschillend beschouwd, zodat een betrouwbaarheidsinterval met een waarde van 1 niet significant verschillend was, P = 0,0566.
De HPLC-resultaten voor de bepaling van de belangrijkste glucosinolaten in ontvette zaadmeelsoorten DFP, IG, PG en Ls staan vermeld in Tabel 1. De belangrijkste glucosinolaten in de geteste zaadmeelsoorten varieerden, met uitzondering van DFP en PG, die beide myrosinaseglucosinolaten bevatten. Het myrosininegehalte in PG was hoger dan in DFP, respectievelijk 33,3 ± 1,5 en 26,5 ± 0,9 mg/g. Ls-zaadpoeder bevatte 36,6 ± 1,2 mg/g glucoglycon, terwijl IG-zaadpoeder 38,0 ± 0,5 mg/g sinapine bevatte.
Larven van de Aedes aegypti-mug werden gedood na behandeling met ontvet zaadmeel, hoewel de effectiviteit van de behandeling varieerde afhankelijk van de plantensoort. Alleen DFP-NT bleek na 24 en 72 uur blootstelling niet giftig voor muggenlarven (Tabel 2). De toxiciteit van het actieve zaadpoeder nam toe met een stijgende concentratie (Fig. 1A, B). De toxiciteit van het zaadmeel voor muggenlarven varieerde significant op basis van het 95% betrouwbaarheidsinterval van de letale dosisverhouding van de LC50-waarden bij beoordelingen na 24 en 72 uur (Tabel 3). Na 24 uur was het toxische effect van Ls-zaadmeel groter dan bij andere zaadmeelbehandelingen, met de hoogste activiteit en maximale toxiciteit voor larven (LC50 = 0,04 g/120 ml dH2O). Larven bleken na 24 uur minder gevoelig voor DFP dan behandeld met IG-, Ls- en PG-zaadpoeder, met LC50-waarden van respectievelijk 0,115, 0,04 en 0,08 g/120 ml dH2O. Deze waarden waren statistisch significant hoger dan de LC50-waarde van 0,211 g/120 ml dH2O (Tabel 3). De LC90-waarden van DFP, IG, PG en Ls waren respectievelijk 0,376, 0,275, 0,137 en 0,074 g/120 ml dH2O (Tabel 2). De hoogste concentratie DFP was 0,12 g/120 ml dH2O. Na 24 uur bedroeg de gemiddelde larvensterfte slechts 12%, terwijl de gemiddelde sterfte van de IG- en PG-larven respectievelijk 51% en 82% bedroeg. Na 24 uur evaluatie bedroeg de gemiddelde larvensterfte bij de hoogste concentratie Ls-zaadmeel (0,075 g/120 ml dH2O) 99% (Fig. 1A).
Sterftecurven werden geschat op basis van de dosis-responsrelatie (Probit) van Ae. Egyptian-larven (derde instar) ten opzichte van de zaadmeelconcentratie 24 uur (A) en 72 uur (B) na de behandeling. De stippellijn geeft de LC50 van de zaadmeelbehandeling weer. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Hitte-geïnactiveerde Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
Bij een evaluatie na 72 uur waren de LC50-waarden van DFP-, IG- en PG-zaadmeel respectievelijk 0,111, 0,085 en 0,051 g/120 ml dH2O. Bijna alle larven die aan Ls-zaadmeel waren blootgesteld, stierven na 72 uur, waardoor de sterftecijfers niet overeenkwamen met de Probit-analyse. In vergelijking met andere zaadmeelsoorten waren de larven minder gevoelig voor de behandeling met DFP-zaadmeel en vertoonden ze statistisch significant hogere LC50-waarden (tabellen 2 en 3). Na 72 uur werden de LC50-waarden voor de behandelingen met DFP-, IG- en PG-zaadmeel geschat op respectievelijk 0,111, 0,085 en 0,05 g/120 ml dH2O. Na 72 uur evaluatie waren de LC90-waarden van DFP-, IG- en PG-zaadpoeders respectievelijk 0,215, 0,254 en 0,138 g/120 ml dH2O. Na 72 uur evaluatie was de gemiddelde larvensterfte voor de DFP-, IG- en PG-zaadmeelbehandelingen bij een maximale concentratie van 0,12 g/120 ml dH2O respectievelijk 58%, 66% en 96% (Fig. 1B). Na 72 uur evaluatie bleek PG-zaadmeel giftiger te zijn dan IG- en DFP-zaadmeel.
Synthetische isothiocyanaten, allylisothiocyanaat (AITC), benzylisothiocyanaat (BITC) en 4-hydroxybenzylisothiocyanaat (4-HBITC), kunnen muggenlarven effectief doden. 24 uur na de behandeling bleek BITC giftiger voor larven met een LC50-waarde van 5,29 ppm, vergeleken met 19,35 ppm voor AITC en 55,41 ppm voor 4-HBITC (Tabel 4). Vergeleken met AITC en BITC heeft 4-HBITC een lagere toxiciteit en een hogere LC50-waarde. Er zijn significante verschillen in de toxiciteit voor muggenlarven van de twee belangrijkste isothiocyanaten (Ls en PG) in het meest potente zaadmeel. De toxiciteit, gebaseerd op de letale dosisverhouding van de LC50-waarden tussen AITC, BITC en 4-HBITC, vertoonde een statistisch significant verschil, waarbij het 95% betrouwbaarheidsinterval van de letale dosisverhouding van de LC50 geen waarde van 1 omvatte (P = 0,05, Tabel 4). De hoogste concentraties van zowel BITC als AITC bleken 100% van de geteste larven te doden (Figuur 2).
Sterftecurven werden geschat op basis van de dosis-responsrelatie (Probit) van Ae. 24 uur na de behandeling bereikten Egyptische larven (larven in het derde stadium) concentraties van synthetisch isothiocyanaat. De stippellijn geeft de LC50 voor de isothiocyanaatbehandeling weer. Benzylisothiocyanaat BITC, allylisothiocyanaat AITC en 4-HBITC.
Het gebruik van plantaardige biopesticiden als bestrijdingsmiddel tegen muggen wordt al lange tijd onderzocht. Veel planten produceren natuurlijke chemicaliën met insecticide werking37. Hun bioactieve stoffen bieden een aantrekkelijk alternatief voor synthetische insecticiden en hebben een groot potentieel voor de bestrijding van plagen, waaronder muggen.
Mosterdplanten worden geteeld voor hun zaden, die gebruikt worden als specerij en als bron van olie. Wanneer mosterdolie uit de zaden wordt gewonnen of wanneer mosterd wordt geëxtraheerd voor gebruik als biobrandstof, 69 is het bijproduct ontvette zaadmeel. Dit zaadmeel behoudt veel van zijn natuurlijke biochemische componenten en hydrolytische enzymen. De toxiciteit van dit zaadmeel wordt toegeschreven aan de productie van isothiocyanaten55,60,61. Isothiocyanaten worden gevormd door de hydrolyse van glucosinolaten door het enzym myrosinase tijdens de hydratatie van zaadmeel38,55,70 en staan bekend om hun fungicide, bactericide, nematicide en insecticide werking, evenals andere eigenschappen, waaronder chemische sensorische effecten en chemotherapeutische eigenschappen61,62,70. Verschillende studies hebben aangetoond dat mosterdplanten en zaadmeel effectief werken als fumiganten tegen bodem- en opgeslagen voedselplagen57,59,71,72. In deze studie hebben we de toxiciteit van vierzadenmeel en de drie bioactieve producten ervan, AITC, BITC en 4-HBITC, voor Aedes-muggenlarven (Aedes aegypti) onderzocht. Het rechtstreeks toevoegen van zadenmeel aan water met muggenlarven activeert naar verwachting enzymatische processen die isothiocyanaten produceren, die giftig zijn voor muggenlarven. Deze biotransformatie werd gedeeltelijk aangetoond door de waargenomen larvicide werking van het zadenmeel en het verlies van insecticide werking wanneer dwergmosterdzaadmeel vóór gebruik werd verhit. Vermoedelijk vernietigt de verhitting de hydrolytische enzymen die glucosinolaten activeren, waardoor de vorming van bioactieve isothiocyanaten wordt voorkomen. Dit is de eerste studie die de insecticide eigenschappen van koolzaadpoeder tegen muggen in een wateromgeving bevestigt.
Van de geteste zaadpoeders was waterkerszaadpoeder (Ls) het meest giftig en veroorzaakte een hoge sterfte onder Aedes albopictus-muggen. Aedes aegypti-larven werden gedurende 24 uur continu behandeld. De overige drie zaadpoeders (PG, IG en DFP) vertoonden een langzamere werking en veroorzaakten na 72 uur continue behandeling nog steeds een aanzienlijke sterfte. Alleen Ls-zaadmeel bevatte significante hoeveelheden glucosinolaten, terwijl PG en DFP myrosinase bevatten en IG glucosinolaat als belangrijkste glucosinolaat (Tabel 1). Glucotropaeoline wordt gehydrolyseerd tot BITC en sinalbine wordt gehydrolyseerd tot 4-HBITC61,62. Onze bioassayresultaten tonen aan dat zowel Ls-zaadmeel als synthetisch BITC zeer giftig zijn voor muggenlarven. Het belangrijkste bestanddeel van PG- en DFP-zaadmeel is myrosinaseglucosinolaat, dat wordt gehydrolyseerd tot AITC. AITC is effectief in het doden van muggenlarven met een LC50-waarde van 19,35 ppm. Vergeleken met AITC en BITC is 4-HBITC-isothiocyanaat het minst giftig voor larven. Hoewel AITC minder giftig is dan BITC, zijn hun LC50-waarden lager dan die van veel essentiële oliën die op muggenlarven zijn getest32,73,74,75.
Ons poeder van kruisbloemige zaden voor gebruik tegen muggenlarven bevat één belangrijk glucosinolaat, dat volgens HPLC-analyse meer dan 98-99% van de totale glucosinolaten uitmaakt. Sporen van andere glucosinolaten werden gedetecteerd, maar hun gehalte was minder dan 0,3% van de totale glucosinolaten. Waterkerszaadpoeder (L. sativum) bevat secundaire glucosinolaten (sinigrine), maar hun aandeel is slechts 1% van de totale glucosinolaten en hun gehalte is nog steeds verwaarloosbaar (ongeveer 0,4 mg/g zaadpoeder). Hoewel PG en DFP hetzelfde belangrijkste glucosinolaat (myrosine) bevatten, verschilt de larvicide werking van hun zaadmeel aanzienlijk door hun LC50-waarden. De toxiciteit voor echte meeldauw varieert. Het uitkomen van Aedes aegypti-larven kan te wijten zijn aan verschillen in myrosinase-activiteit of -stabiliteit tussen de twee zaadvoeders. De activiteit van myrosinase speelt een belangrijke rol in de biologische beschikbaarheid van hydrolyseproducten zoals isothiocyanaten in Brassicaceae-planten76. Eerdere rapporten van Pocock et al.77 en Wilkinson et al.78 hebben aangetoond dat veranderingen in de activiteit en stabiliteit van myrosinase ook verband kunnen houden met genetische en omgevingsfactoren.
Het verwachte gehalte aan bioactieve isothiocyanaten werd berekend op basis van de LC50-waarden van elk zaadmeel na 24 en 72 uur (Tabel 5) ter vergelijking met overeenkomstige chemische toepassingen. Na 24 uur bleken de isothiocyanaten in het zaadmeel giftiger te zijn dan de zuivere verbindingen. De LC50-waarden, berekend op basis van delen per miljoen (ppm) van de isothiocyanaatbehandelingen met zaadmeel, waren lager dan de LC50-waarden voor de BITC-, AITC- en 4-HBITC-toepassingen. We observeerden dat larven zaadmeelkorrels consumeerden (Figuur 3A). Hierdoor kunnen larven een hogere concentratie giftige isothiocyanaten binnenkrijgen door het eten van zaadmeelkorrels. Dit was het duidelijkst bij de IG- en PG-zaadmeelbehandelingen na 24 uur blootstelling, waarbij de LC50-concentraties respectievelijk 75% en 72% lager waren dan bij de zuivere AITC- en 4-HBITC-behandelingen. De behandelingen met Ls en DFP waren giftiger dan zuiver isothiocyanaat, met LC50-waarden die respectievelijk 24% en 41% lager lagen. Larven in de controlegroep verpopten succesvol (Fig. 3B), terwijl de meeste larven in de zaadmeelbehandeling niet verpopten en de larvale ontwikkeling aanzienlijk vertraagd was (Fig. 3B,D). Bij Spodopteralitura worden isothiocyanaten in verband gebracht met groeivertraging en ontwikkelingsvertraging79.
Larven van de Aedes aegypti-mug werden gedurende 24-72 uur continu blootgesteld aan Brassica-zaadpoeder. (A) Dode larven met deeltjes zaadmeel in de monddelen (omcirkeld); (B) Controlebehandeling (dH20 zonder toegevoegd zaadmeel) laat zien dat de larven normaal groeien en na 72 uur beginnen te verpoppen; (C, D) Larven behandeld met zaadmeel; het zaadmeel vertoonde verschillen in ontwikkeling en verpopte niet.
We hebben het mechanisme van de toxische effecten van isothiocyanaten op muggenlarven nog niet onderzocht. Eerdere studies bij rode vuurmieren (Solenopsis invicta) hebben echter aangetoond dat remming van glutathion S-transferase (GST) en esterase (EST) het belangrijkste mechanisme is van de bioactiviteit van isothiocyanaten, en dat AITC, zelfs bij lage activiteit, ook de GST-activiteit kan remmen bij rode geïmporteerde vuurmieren in lage concentraties. De dosis bedraagt 0,5 µg/ml80. Daarentegen remt AITC acetylcholinesterase bij volwassen maïskevers (Sitophilus zeamais)81. Vergelijkbare studies zijn nodig om het mechanisme van de activiteit van isothiocyanaten bij muggenlarven op te helderen.
We gebruiken hitte-geïnactiveerde DFP-behandeling om het voorstel te ondersteunen dat de hydrolyse van plantaardige glucosinolaten tot reactieve isothiocyanaten dient als mechanisme voor de bestrijding van muggenlarven door mosterdzaadmeel. DFP-HT-zaadmeel bleek niet giftig te zijn bij de geteste toepassingsdoseringen. Lafarga et al. 82 rapporteerden dat glucosinolaten gevoelig zijn voor afbraak bij hoge temperaturen. Verwacht wordt dat hittebehandeling ook het myrosinase-enzym in zaadmeel denatureert en de hydrolyse van glucosinolaten tot reactieve isothiocyanaten voorkomt. Dit werd ook bevestigd door Okunade et al. 75, die aantoonden dat myrosinase temperatuurgevoelig is, en lieten zien dat de myrosinase-activiteit volledig werd geïnactiveerd toen mosterd-, zwarte mosterd- en bloedwortelzaden werden blootgesteld aan temperaturen boven 80 °C. Deze mechanismen kunnen leiden tot verlies van insecticide activiteit van hittebehandeld DFP-zaadmeel.
Mosterdzaadmeel en de drie belangrijkste isothiocyanaten ervan zijn dus giftig voor muggenlarven. Gezien deze verschillen tussen zaadmeel en chemische bestrijdingsmiddelen, kan het gebruik van zaadmeel een effectieve methode zijn voor muggenbestrijding. Er is behoefte aan geschikte formuleringen en effectieve toedieningssystemen om de werkzaamheid en stabiliteit van het gebruik van zaadpoeders te verbeteren. Onze resultaten wijzen op het potentiële gebruik van mosterdzaadmeel als alternatief voor synthetische pesticiden. Deze technologie zou een innovatief hulpmiddel kunnen worden voor de bestrijding van muggen. Omdat muggenlarven gedijen in waterige omgevingen en de glucosinolaten in zaadmeel bij hydratatie enzymatisch worden omgezet in actieve isothiocyanaten, biedt het gebruik van mosterdzaadmeel in met muggen besmet water een aanzienlijk bestrijdingspotentieel. Hoewel de larvicide activiteit van isothiocyanaten varieert (BITC > AITC > 4-HBITC), is meer onderzoek nodig om te bepalen of de combinatie van zaadmeel met meerdere glucosinolaten de toxiciteit synergetisch verhoogt. Dit is de eerste studie die de insecticide werking van ontvette kruisbloemzaadmeel en drie bioactieve isothiocyanaten op muggen aantoont. De resultaten van deze studie zijn baanbrekend, omdat ze aantonen dat ontvette koolzaadmeel, een bijproduct van de olie-extractie uit de zaden, een veelbelovend larvicide middel kan zijn voor de bestrijding van muggen. Deze informatie kan bijdragen aan de verdere ontdekking van plantaardige biologische bestrijdingsmiddelen en de ontwikkeling ervan tot goedkope, praktische en milieuvriendelijke biopesticiden.
De datasets die voor dit onderzoek zijn gegenereerd en de daaruit voortvloeiende analyses zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur. Aan het einde van het onderzoek werden alle gebruikte materialen (insecten en zaadmeel) vernietigd.
Geplaatst op: 29 juli 2024