Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor het beste resultaat raden we u aan een nieuwere versie van uw browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder opmaak of JavaScript.
De ontdekking en het nuttige gebruik van natuurlijke producten kunnen bijdragen aan de verbetering van het menselijk leven. Plantengroeiremmende chemicaliën worden veelvuldig gebruikt als herbiciden om onkruid te bestrijden. Vanwege de noodzaak om verschillende soorten herbiciden te gebruiken, bestaat er behoefte aan het identificeren van verbindingen met nieuwe werkingsmechanismen. In deze studie ontdekten we een nieuwe N-alkoxypyrroolverbinding, coumamonamide, uit Streptomyces werraensis MK493-CF1 en brachten we het volledige syntheseproces in kaart. Door middel van biologische activiteitstesten ontdekten we dat urs-monoamzuur een synthetisch tussenproduct is van urs-monoamide en een potentieelplantengroeiremmerDaarnaast hebben we verschillende urbenonzuurderivaten ontwikkeld, waaronder het urbenyloxyderivaat (UDA), dat een hoge herbicideactiviteit heeft zonder de groei van HeLa-cellen negatief te beïnvloeden. We ontdekten ook dat urmotonzuurderivaten plantenmicrotubuli verstoren; bovendien beïnvloedt KAND actinefilamenten en induceert het celdood. Deze veelzijdige effecten verschillen van die van bekende microtubuli-remmers en suggereren een nieuw werkingsmechanisme voor ursonzuur, wat een belangrijk voordeel is bij de ontwikkeling van nieuwe herbiciden.
De ontdekking en praktische toepassing van nuttige natuurlijke producten en hun derivaten is een middel om de kwaliteit van het menselijk leven te verbeteren. Secundaire metabolieten geproduceerd door micro-organismen, planten en insecten hebben geleid tot grote vooruitgang in de geneeskunde en de landbouw. Veel antibiotica en geneesmiddelen tegen leukemie zijn ontwikkeld op basis van natuurlijke producten. Daarnaast zijn er verschillende soortenbestrijdingsmiddelenFungiciden en herbiciden worden uit deze natuurlijke producten gewonnen voor gebruik in de landbouw. Met name herbiciden voor onkruidbestrijding zijn belangrijke hulpmiddelen voor het verhogen van de gewasopbrengst in de moderne landbouw, en verschillende soorten verbindingen worden al commercieel gebruikt. Verschillende cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese, aminozuurmetabolisme, celwandsynthese, regulatie van mitose, fytohormoonsignalering of eiwitsynthese, worden beschouwd als typische doelwitten van herbiciden. Verbindingen die de microtubulefunctie remmen, vormen een veelvoorkomende klasse herbiciden die de plantengroei beïnvloeden door de regulatie van de mitose te verstoren².
Microtubuli zijn componenten van het cytoskelet en komen veelvuldig voor in eukaryotische cellen. Het tubuline-heterodimeer bestaat uit α-tubuline en β-tubuline die lineaire microtubuli-protofilamenten vormen, waarbij 13 protofilamenten een cilindrische structuur vormen. Microtubuli spelen diverse rollen in plantencellen, waaronder het bepalen van de celvorm, celdeling en intracellulair transport3,4. Plantencellen bevatten microtubuli onder het interfase-plasmamembraan, en men vermoedt dat deze zogenaamde corticale microtubuli de organisatie van cellulosemicrofibrillen reguleren door middel van de regulatie van cellulosesynthasecomplexen4,5. Corticale microtubuli van wortelepidermiscellen, aanwezig in de zone van snelle elongatie van de wortelpunt, bevinden zich lateraal, en cellulosemicrovezels volgen deze microtubuli en beperken de richting van de celgroei, waardoor anisotrope celelongatie wordt bevorderd. De functie van microtubuli is dus nauw verbonden met de morfologie van planten. Aminozuurvervangingen in genen die coderen voor tubuline veroorzaken een scheefgroei van corticale microtubuli en links- of rechtszijdige groei in Arabidopsis 6,7. Op vergelijkbare wijze kunnen mutaties in microtubuli-geassocieerde eiwitten die de microtubuli-dynamiek reguleren ook leiden tot verstoorde wortelgroei8,9,10,11,12,13. Daarnaast veroorzaakt behandeling met microtubuli-verstorende herbiciden zoals disopyramide, ook bekend als pretilachlor, eveneens linkszijdige schuine wortelgroei14. Deze gegevens tonen aan dat een precieze regulatie van de microtubuli-functie cruciaal is voor het bepalen van de groeirichting van de plant.
Er zijn verschillende soorten microtubule-remmers ontdekt, en deze geneesmiddelen hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan cytoskeletonderzoek, evenals aan de landbouw en de geneeskunde². Met name oryzaline, dinitroanilineverbindingen, disopyramide, benzamide-gerelateerde verbindingen en hun analogen kunnen de microtubulefunctie remmen en daardoor de plantengroei belemmeren. Daarom worden ze veelvuldig gebruikt als herbiciden. Omdat microtubulen echter een belangrijk onderdeel vormen van planten- en dierencellen, zijn de meeste microtubule-remmers cytotoxisch voor beide celtypen. Ondanks hun erkende nut als herbiciden wordt daarom slechts een beperkt aantal antimicrotubule-middelen in de praktijk gebruikt.
Streptomyces is een geslacht binnen de familie Streptomyces, waartoe aerobe, grampositieve, draadvormige bacteriën behoren. Het geslacht staat bekend om zijn vermogen om een breed scala aan secundaire metabolieten te produceren en wordt daarom beschouwd als een van de belangrijkste bronnen van nieuwe biologisch actieve natuurlijke producten. In deze studie ontdekten we een nieuwe verbinding, coumamonamide genaamd, die werd geïsoleerd uit Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Met behulp van spectrale analyse en volledige spectrale analyse werd de structuur van coumamonamide gekarakteriseerd en het unieke N-alkoxypyrroolskelet bepaald. Ursmonzuur, een synthetisch tussenproduct van ursmonamide en zijn derivaten, bleek de groei en kieming van de populaire modelplant Arabidopsis thaliana te remmen. In een structuur-activiteitsrelatiestudie ontdekten we dat een verbinding met C9 gemodificeerd tot ursonzuur, genaamd nonyloxyderivaat van ursonzuur (KAND), het remmende effect op groei en kieming aanzienlijk versterkt. Opvallend is dat deze nieuw ontdekte plantengroeiremmer ook de groei van tabak en levermos beïnvloedde en niet cytotoxisch was voor bacteriën of HeLa-cellen. Bovendien induceren sommige urmonzuurderivaten een verstoord wortelfenotype, wat impliceert dat deze derivaten de microtubuli direct of indirect beïnvloeden. In lijn met dit idee tonen onze waarnemingen van microtubuli, gelabeld met immunohistochemische of fluorescerende eiwitten, aan dat behandeling met KAND de microtubuli depolymeriseert. Daarnaast verstoorde behandeling met kumamonzuurderivaten de actine-microfilamenten. We hebben dus een nieuwe plantengroeiremmer ontdekt waarvan het unieke werkingsmechanisme de vernietiging van het cytoskelet omvat.
Stam MK493-CF1 werd geïsoleerd uit de bodem in Shinagawa-ku, Tokio. Stam MK493-CF1 vormde een goed vertakt stromaal mycelium. De partiële sequentie van het 16S ribosomaal RNA-gen (1422 bp) werd bepaald. Deze stam vertoont grote gelijkenis met S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typische stam, 99,93%). Op basis van dit resultaat werd vastgesteld dat deze stam nauw verwant is aan de type-stam van S. werraensis. Daarom hebben we deze stam voorlopig S. werraensis MK493-CF1 genoemd. S. werraensis ISP 5486T produceert ook dezelfde bioactieve stoffen. Omdat er weinig eerder onderzoek is gedaan naar het verkrijgen van natuurlijke producten uit dit micro-organisme, werd verder chemisch onderzoek uitgevoerd. Na de kweek van S. werraensis MK493-CF1 op gerstmedium door middel van vaste-stoffermentatie bij 30 °C gedurende 14 dagen, werd het medium geëxtraheerd met 50% ethanol. 60 ml van het monster werd gedroogd om 59,5 mg ruw extract te verkrijgen. Het ruwe extract werd onderworpen aan reversed-phase HPLC, wat N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, genaamd kumamotoamide, 36,0 mg) opleverde. De totale hoeveelheid van 1 is ongeveer 60% van het ruwe extract. Daarom besloten we de eigenschappen van kumamotoamide 1 nader te bestuderen.
Coumamonamide 1 is een wit amorf poeder en hogeresolutie-massaspectrometrie (HRESIMS) bevestigt C6H8N2O2 (Fig. 1). Het C2-gesubstitueerde pyrroolfragment van deze verbinding wordt gekarakteriseerd door δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH in 1H NMR-spectrum: 4,5 Hz, H-5) en δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), en het 13C NMR-spectrum toont de aanwezigheid van vier sp2-koolstofatomen. De aanwezigheid van een amidegroep op de C2-positie werd vastgesteld door HMBC-correlatie van het C-3-proton naar het amidecarbonylkoolstofatoom bij δC 161,1. Bovendien duiden de 1H- en 13C-NMR-pieken bij δH 4,10 (3H, S) en δC 68,3 op de aanwezigheid van N-methoxygroepen in het molecuul. Hoewel de precieze positie van de methoxygroep nog niet was vastgesteld met behulp van spectroscopische analyses zoals enhanced difference spectroscopy en nuclear Overhauser abbreviation (NOEDF), werd N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide als eerste kandidaatverbinding aangewezen.
Om de correcte structuur van 1 te bepalen, werd een totale synthese uitgevoerd (Fig. 2a). Behandeling van commercieel verkrijgbaar 2-aminopyridine 2 met m-CPBA resulteerde in het overeenkomstige N-oxide 3 met een kwantitatieve opbrengst. Na de 2-aminoazidatie van 2 werd de door Abramovich beschreven cyclocondensatiereactie uitgevoerd in benzeen bij 90 °C om het gewenste 1-hydroxy-1H-pyrrool-2-carbonitril 5 te verkrijgen in grammen. Snelheid 60% (twee stappen). 15,16. Methylering en hydrolyse van 4 leverden vervolgens 1-methoxy-1H-pyrrool-2-carbonzuur (ook wel "cumotonzuur" genoemd), 6, op met een goede opbrengst (70%, twee stappen). Ten slotte leverde amidatie via het zuurchloride-tussenproduct 6 met behulp van waterig ammoniak het Kumamoto-amide 1 op met een opbrengst van 98%. Alle spectrale gegevens van het gesynthetiseerde 1 waren vergelijkbaar met die van het geïsoleerde 1, waardoor de structuur van 1 kon worden vastgesteld;
Algemene synthese en analyse van de biologische activiteit van urbenamide en urbeenzuur. (a) Totale synthese van Kumamoto-amide. (b) Zeven dagen oude zaailingen van het wilde type Arabidopsis Columbia (Col) werden gekweekt op Murashige en Skoog (MS)-platen met coumamonamide 6 of coumamonamide 1 in de aangegeven concentraties. Schaalbalk = 1 cm.
Allereerst hebben we de biologische activiteiten van urbenamide en de tussenproducten ervan onderzocht op hun vermogen om plantengroei te moduleren. We voegden verschillende concentraties ursmonamide 1 of ursmonzuur 6 toe aan MS-agar en kweekten Arabidopsis thaliana-zaailingen op dit medium. Deze experimenten toonden aan dat hoge concentraties (500 μM) van 6 de wortelgroei remden (Fig. 2b). Vervolgens genereerden we verschillende derivaten door de N1-positie van 6 te substitueren en voerden we structuur-activiteitsrelatiestudies uit (het syntheseproces van de analogen wordt beschreven in de aanvullende informatie (SI)). Arabidopsis-zaailingen werden gekweekt op een medium met 50 μM ursonzuurderivaten en de wortellengte werd gemeten, zoals weergegeven in de afbeelding. Zoals weergegeven in figuren 3a, b en S1, hebben coumamozuren verschillende lengtes van lineaire alkoxyketens (9, 10, 11, 12 en 13) of grote alkoxyketens (15, 16 en 17) op de N1-positie. De derivaten vertoonden een significante remming van de wortelgroei. Bovendien ontdekten we dat toepassing van 200 μM 10, 11 of 17 de kieming remde (figuren 3c en S2).
Onderzoek naar de structuur-activiteitsrelatie van Kumamoto-amide en verwante verbindingen. (a) Structuur en syntheseschema van analogen. (b) Kwantificering van de wortellengte van 7 dagen oude zaailingen gekweekt op MS-medium met of zonder 50 μM coumamonamide-derivaten. Sterretjes geven significante verschillen aan ten opzichte van de schijnbehandeling (t-test, p < 0,05).< 0,05). n>18. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. nt betekent "niet getest" omdat meer dan 50% van de zaden niet ontkiemde. (c) Kwantificering van het kiempercentage van behandelde zaden die 7 dagen in MS-medium zijn geïncubeerd met of zonder 200 μM coumamonamide en verwante verbindingen. Sterretjes geven significante verschillen aan ten opzichte van de schijnbehandeling (chi-kwadraat toets). n=96.
Opvallend genoeg verminderde de toevoeging van alkylzijketens langer dan C9 de remmende activiteit, wat suggereert dat kumamotoïnezuur-gerelateerde verbindingen zijketens van een bepaalde grootte nodig hebben om hun biologische activiteit te vertonen.
Omdat uit structuur-activiteitsrelatieanalyse bleek dat C9 gemodificeerd was tot ursonzuur en het nonyloxyderivaat van ursonzuur (hierna KAND 11 genoemd) de meest effectieve plantengroeiremmer was, hebben we KAND 11 nader gekarakteriseerd. Behandeling van Arabidopsis met 50 μM KAND 11 voorkwam de kieming vrijwel volledig, terwijl lagere concentraties (40, 30, 20 of 10 μM) van KAND 11 de wortelgroei dosisafhankelijk remden (Fig. 4a, b). Om te testen of KAND 11 de levensvatbaarheid van wortelmeristemen beïnvloedt, hebben we wortelmeristemen onderzocht die gekleurd waren met propidiumjodide (PI) en de oppervlakte van het meristeem gemeten. De grootte van het meristeem van zaailingen die gekweekt werden op een medium met 25 μM KAND-11 was 151,1 ± 32,5 μm, terwijl de grootte van het meristeem van zaailingen die gekweekt werden op een controlemedium met DMSO 264,7 ± 30,8 μm was (Fig. 4c, d). Dit duidt erop dat KAND-11 de cellulaire activiteit herstelt. Wortelmeristeem. In overeenstemming hiermee verminderde de behandeling met KAND-11 de hoeveelheid signaal van de celdelingsmarker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS in het wortelmeristeem (Fig. 4e) 17. Deze resultaten geven aan dat KAND-11 de wortelgroei remt door de celproliferatieactiviteit te verminderen.
Analyse van het remmende effect van urbenonzuurderivaten (urbenyloxyderivaten) op de groei. (a) 7 dagen oude wilde Col-zaailingen gekweekt op MS-platen met de aangegeven concentraties KAND 11. Schaalbalk = 1 cm. (b) Kwantificering van de wortellengte. Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p < 0,05).< 0,05). n>16. De gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. (c) Confocale microscopie van met propidiumjodide gekleurde wildtype Col-wortels gekweekt op MS-platen met of zonder 25 μM KAND 11. Witte haakjes geven het wortelmeristeem aan. Schaalbalk = 100 µm. (d) Kwantificering van de grootte van het wortelmeristeem (n = 10 tot 11). Statistische verschillen werden bepaald met behulp van een t-test (p < 0,05).< 0,05). De balken geven de gemiddelde meristeemgrootte weer. (e) Differentieel interferentiecontrast (DIC)-microscopie van een wortelmeristeem met het CDKB2-construct; 1pro: CDKB2; 1-GUS-kleuring op 5 dagen oude zaailingen gekweekt op MS-platen met of zonder 25 µM KAND-assay.
De fytotoxiciteit van KAND 11 werd verder getest met behulp van een andere tweezaadlobbige plant, tabak (Nicotiana tabacum), en een belangrijk modelorganisme voor landplanten, levermos (Marchantia polymorpha). Net als bij Arabidopsis produceerden tabakszaailingen van het SR-1-ras, gekweekt op een medium met 25 μM KAND 11, kortere wortels (Fig. 5a). Bovendien kiemden 40 van de 48 zaden op platen met 200 μM KAND 11, terwijl alle 48 zaden kiemden op onbehandelde media, wat aangeeft dat hogere concentraties KAND significant waren (p < 0,05).< 0,05; chi-kwadraattoets) remde de kieming van tabak (Fig. 5b). Bovendien was de concentratie van KAND 11 die de bacteriële groei in levermos remde vergelijkbaar met de effectieve concentratie in Arabidopsis (Fig. 5c). Deze resultaten geven aan dat KAND 11 de groei van verschillende planten kan remmen. Vervolgens onderzochten we de mogelijke cytotoxiciteit van monoamide-gerelateerde verbindingen in andere organismen, namelijk menselijke HeLa-cellen en Escherichia coli-stam DH5α, als representanten van respectievelijk hogere dierlijke en bacteriële cellen. In een reeks celproliferatietests observeerden we dat coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6 en KAND 11 de groei van HeLa- of E. coli-cellen niet beïnvloedden bij concentraties van 100 μM (Fig. 5d,e).
Groeiremming van KAND 11 in niet-Arabidopsis-organismen. (a) Twee weken oude zaailingen van het wildtype SR-1 tabak werden gekweekt op verticaal geplaatste MS-platen met 25 μM KAND 11. (b) Twee weken oude zaailingen van het wildtype SR-1 tabak werden gekweekt op horizontaal geplaatste MS-platen met 200 μM KAND 11. (c) Twee weken oude knoppen van het wildtype Tak-1 levermos werden gekweekt op Gamborg B5-platen met de aangegeven concentraties KAND 11. Rode pijlen geven sporen aan die binnen de incubatieperiode van twee weken niet meer groeiden. (d) Celproliferatietest met HeLa-cellen. Het aantal levensvatbare cellen werd op vaste tijdsintervallen gemeten met behulp van een celcountingkit 8 (Dojindo). Als controle werden HeLa-cellen behandeld met 5 μg/ml actinomycine D (Act D), dat de transcriptie van RNA-polymerase remt en celdood veroorzaakt. De analyses werden in drievoud uitgevoerd. (e) E. coli-celproliferatietest. De groei van E. coli werd geanalyseerd door de OD600 te meten. Als controle werden cellen behandeld met 50 μg/ml ampicilline (Amp), wat de bacteriële celwandsynthese remt. De analyses werden in drievoud uitgevoerd.
Om het werkingsmechanisme van cytotoxiciteit veroorzaakt door uramide-gerelateerde verbindingen te ontcijferen, hebben we urbeenzuurderivaten met matige remmende effecten opnieuw geanalyseerd, zoals weergegeven in de afbeelding. Zoals te zien is in figuren 2b en 6a, produceerden zaailingen die gekweekt werden op agarplaten met hoge concentraties (200 μM) urmotonzuur 6 kortere en naar links gebogen wortels (θ = – 23,7 ± 6,1), terwijl zaailingen die gekweekt werden op het controlemiddel bijna rechte wortels produceerden (θ = – 3,8 ± 7,1). Deze karakteristieke schuine groei is bekend als gevolg van een disfunctie van corticale microtubuli14,18. In overeenstemming met deze bevinding induceerden de microtubuli-destabiliserende geneesmiddelen disopyramide en oryzaline een vergelijkbare wortelkanteling onder onze groeiomstandigheden (figuren 2b en 6a). Tegelijkertijd testten we urmotonzuurderivaten en selecteerden we er een aantal die bij bepaalde concentraties een schuine wortelgroei induceerden. De verbindingen 8, 9 en 15 veranderden de richting van de wortelgroei bij respectievelijk 75 μM, 50 μM en 40 μM, wat aangeeft dat deze verbindingen microtubuli effectief kunnen destabiliseren (Fig. 2b, 6a). We testten ook het meest potente ursolzuurderivaat, KAND 11, bij een lagere concentratie (15 µM) en ontdekten dat toepassing van KAND 11 de wortelgroei remde en dat de richting van de wortelgroei ongelijkmatig was, hoewel ze de neiging hadden naar links te hellen (Figuur C3). Omdat hogere concentraties van microtubuli-destabiliserende geneesmiddelen soms de plantengroei remmen in plaats van wortelkanteling te veroorzaken, onderzochten we vervolgens de mogelijkheid dat KAND 11 microtubuli beïnvloedt door corticale microtubuli in wortelepidermale cellen te observeren. Immunohistochemisch onderzoek met anti-β-tubuline-antilichamen in epidermale cellen van zaailingwortels behandeld met 25 μM KAND 11 toonde het verdwijnen van vrijwel alle corticale microtubuli in epidermale cellen in de elongatiezone (Fig. 6b). Deze resultaten geven aan dat kumamotonzuur en zijn derivaten direct of indirect inwerken op microtubuli om ze te verstoren en dat deze verbindingen nieuwe microtubuli-remmers zijn.
Ursonzuur en zijn derivaten veranderen corticale microtubuli in Arabidopsis thaliana. (a) Wortelhellingshoek gemeten in aanwezigheid van verschillende ursonzuurderivaten bij de aangegeven concentraties. De effecten van twee verbindingen waarvan bekend is dat ze microtubuli remmen: disopyramide en oryzaline, werden ook geanalyseerd. De inzet toont de standaard die gebruikt werd om de wortelgroeihoek te meten. Sterretjes geven significante verschillen aan ten opzichte van de schijnbehandeling (t-test, p < 0,05).< 0,05). n>19. Schaalbalk = 1 cm. (b) Corticale microtubuli in epidermale cellen in de elongatiezone. Microtubuli in wortels van wildtype Arabidopsis Col, gekweekt op MS-platen met of zonder 25 μM KAND 11, werden gevisualiseerd door immunohistochemische kleuring met behulp van β-tubuline primaire antilichamen en Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen. Schaalbalk = 10 µm. (c) Mitotische structuur van microtubuli in het wortelmeristeem. Microtubuli werden gevisualiseerd met behulp van immunohistochemische kleuring. Mitotische structuren, waaronder profasezones, spoelen en fragmoplasten, werden geteld aan de hand van confocale beelden. Pijlen geven mitotische microtubuli-structuren aan. Sterretjes geven significante verschillen aan ten opzichte van de schijnbehandeling (t-test, p < 0,05).< 0,05). n>9. Schaalbalk = 50 µm.
Hoewel Ursa de microtubulefunctie kan verstoren, wordt verwacht dat het werkingsmechanisme ervan verschilt van dat van typische microtubule-depolymeriserende middelen. Hogere concentraties van microtubule-depolymeriserende middelen zoals disopyramide en oryzaline induceren bijvoorbeeld anisotrope expansie van epidermale cellen, terwijl KAND 11 dat niet doet. Bovendien resulteerde gelijktijdige toepassing van KAND 11 en disopyramide in een gecombineerde door disopyramide geïnduceerde wortelgroeirespons en werd door KAND 11 geïnduceerde groeiremming waargenomen (Fig. S4). We analyseerden ook de respons van de hypersensitieve disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant op KAND 11. phs1-1 heeft een niet-canonieke tubulinekinase-puntmutatie en produceert kortere wortels bij behandeling met disopyramide9,20. Zaailingen van de phs1-1 mutant, gekweekt op agarmedium met KAND 11, hadden kortere wortels, vergelijkbaar met die gekweekt op disopyramide (fig. S5).
Bovendien observeerden we mitotische microtubule-structuren, zoals profasezones, spoelen en fragmoplasten, in het wortelmeristeem van zaailingen die behandeld waren met KAND 11. In overeenstemming met de waarnemingen voor CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS werd een significante afname van het aantal mitotische microtubuli waargenomen (Fig. 6c).
Om de cytotoxiciteit van KAND 11 op subcellulair niveau te karakteriseren, behandelden we tabak BY-2-suspensiecellen met KAND 11 en observeerden we hun respons. We voegden eerst KAND 11 toe aan BY-2-cellen die TagRFP-TUA6 tot expressie brachten, een fluorescentielabel voor microtubuli, om het effect van KAND 11 op corticale microtubuli te beoordelen. De dichtheid van corticale microtubuli werd bepaald met behulp van beeldanalyse, waarbij het percentage cytoskeletale pixels ten opzichte van cytoplasmatische pixels werd gekwantificeerd. De resultaten van de analyse toonden aan dat na behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 gedurende 1 uur de dichtheid significant afnam tot respectievelijk 0,94 ± 0,74% of 0,23 ± 0,28%, terwijl de dichtheid van cellen behandeld met DMSO 1,61 ± 0,34% bedroeg (Fig. 7a). Deze resultaten komen overeen met de waarneming in Arabidopsis dat behandeling met KAND 11 depolymerisatie van corticale microtubuli induceert (Fig. 6b). We hebben ook de BY-2-lijn onderzocht met GFP-ABD-gelabelde actinefilamenten na behandeling met dezelfde concentratie KAND 11 en waargenomen dat behandeling met KAND 11 de actinefilamenten verstoorde. Behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 gedurende 1 uur verminderde de dichtheid van actinefilamenten significant tot respectievelijk 1,20 ± 0,62% of 0,61 ± 0,26%, terwijl de dichtheid in met DMSO behandelde cellen 1,69 ± 0,51% was (Fig. 2b). Deze resultaten staan in contrast met de effecten van propyzamide, dat geen effect heeft op actinefilamenten, en latrunculine B, een actine-depolymerisator die geen effect heeft op microtubuli (SI Figuur S6). Bovendien had behandeling met coumamonamide 1, coumamonamidezuur 6 of KAND 11 geen effect op de microtubuli in HeLa-cellen (zie Aanvullende informatie, Figuur S7). Het werkingsmechanisme van KAND 11 is dus vermoedelijk anders dan dat van bekende cytoskeletverstoorders. Verder toonde onze microscopische observatie van BY-2-cellen behandeld met KAND 11 het begin van celdood tijdens de behandeling met KAND 11 aan. Het percentage met Evansblauw gekleurde dode cellen nam na 30 minuten behandeling met KAND 11 niet significant toe, terwijl na 90 minuten behandeling met 50 μM of 100 μM KAND het aantal dode cellen respectievelijk toenam tot 43,7% of 80,1% (Fig. 7c). Al met al wijzen deze gegevens erop dat het nieuwe ursolzuurderivaat KAND 11 een plant-specifieke cytoskeletremmer is met een voorheen onbekend werkingsmechanisme.
KAND beïnvloedt corticale microtubuli, actinefilamenten en de levensvatbaarheid van tabak BY-2-cellen. (a) Visualisatie van corticale microtubuli in BY-2-cellen in aanwezigheid van TagRFP-TUA6. BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met confocale microscopie. De dichtheid van corticale microtubuli werd berekend aan de hand van microfoto's van 25 onafhankelijke cellen. Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p < 0,05).< 0,05). Schaalbalk = 10 µm. (b) Corticale actinefilamenten in BY-2-cellen gevisualiseerd in aanwezigheid van GFP-ABD2. BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met confocale microscopie. De dichtheid van corticale actinefilamenten werd berekend aan de hand van microfoto's van 25 onafhankelijke cellen. Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p < 0,05).< 0,05). Schaalbalk = 10 µm. (c) Observatie van dode BY-2-cellen door kleuring met Evansblauw. BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 µM of 100 µM) of DMSO werden onderzocht met behulp van helderveldmicroscopie. n=3. Schaalbalk = 100 µm.
De ontdekking en toepassing van nieuwe natuurlijke producten heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang op diverse gebieden van het menselijk leven, waaronder geneeskunde en landbouw. Historisch onderzoek is verricht om nuttige verbindingen uit natuurlijke bronnen te verkrijgen. Met name actinomyceten staan bekend als nuttige antiparasitaire antibiotica voor nematoden vanwege hun vermogen om verschillende secundaire metabolieten te produceren, zoals avermectine, de basisverbinding van ivermectine, en bleomycine en de derivaten daarvan, die medicinaal worden gebruikt als antikankermiddel21,22. Evenzo zijn er diverse herbiciden ontdekt in actinomyceten, waarvan sommige al commercieel worden gebruikt1,23. Daarom wordt de analyse van actinomycetenmetabolieten om natuurlijke producten met de gewenste biologische activiteiten te isoleren beschouwd als een effectieve strategie. In deze studie ontdekten we een nieuwe verbinding, coumamonamide, uit S. werraensis en synthetiseerden deze met succes. Ursonzuur is een synthetisch tussenproduct van urbenamide en de derivaten daarvan. Het kan karakteristieke wortelkrulling veroorzaken, een matige tot sterke herbicide werking vertonen en plantenmicrotubuli direct of indirect beschadigen. Het werkingsmechanisme van urmotonzuur kan echter verschillen van dat van bestaande microtubuli-remmers, aangezien KAND 11 ook actinefilamenten verstoort en celdood veroorzaakt. Dit suggereert een regulerend mechanisme waarmee urmotonzuur en zijn derivaten een breed scala aan cytoskeletstructuren beïnvloeden.
Een gedetailleerdere karakterisering van ursonzuur zal bijdragen aan een beter begrip van het werkingsmechanisme ervan. Het volgende doel is met name om het vermogen van ursonzuur om zich te binden aan gereduceerde microtubuli te evalueren. Dit om te bepalen of ursonzuur en zijn derivaten rechtstreeks op microtubuli inwerken en deze depolymeriseren, of dat hun werking resulteert in destabilisatie van microtubuli. Bovendien zal, in het geval dat microtubuli geen direct doelwit zijn, het identificeren van de werkingsplaats en de moleculaire doelwitten van ursonzuur in plantencellen bijdragen aan een beter begrip van de eigenschappen van verwante verbindingen en mogelijke manieren om de herbicideactiviteit te verbeteren. Onze bioactiviteitstest toonde het unieke cytotoxische vermogen van ursonzuur aan op de groei van planten zoals Arabidopsis thaliana, tabak en levermos, terwijl E. coli en HeLa-cellen niet werden aangetast. De geringe of geen toxiciteit voor dierlijke cellen is een voordeel van ursonzuurderivaten als deze worden ontwikkeld als herbiciden voor gebruik op open landbouwvelden. Omdat microtubuli veel voorkomen in eukaryoten, is de selectieve remming ervan in planten een essentiële vereiste voor herbiciden. Propyzamide, een microtubuli-depolymeriserend middel dat rechtstreeks aan tubuline bindt en polymerisatie remt, wordt bijvoorbeeld als herbicide gebruikt vanwege de lage toxiciteit voor dierlijke cellen24. In tegenstelling tot disopyramide hebben verwante benzamiden een andere doelspecificiteit. Naast microtubuli in planten remmen RH-4032 of benzoxamide ook microtubuli van respectievelijk dierlijke cellen of oomyceten, en zalilamide wordt als fungicide gebruikt vanwege de lage fytotoxiciteit25,26,27. De recent ontdekte bear en zijn derivaten vertonen selectieve cytotoxiciteit tegen planten, maar het is belangrijk op te merken dat verdere modificaties hun doelspecificiteit kunnen veranderen, wat mogelijk extra derivaten oplevert voor de bestrijding van pathogene schimmels of oomyceten.
De unieke eigenschappen van urbenonzuur en zijn derivaten zijn nuttig voor de ontwikkeling ervan als herbiciden en voor gebruik als onderzoeksinstrumenten. Het belang van het cytoskelet bij het beheersen van de vorm van plantencellen is algemeen erkend. Eerdere studies hebben aangetoond dat planten complexe mechanismen voor de organisatie van corticale microtubuli hebben ontwikkeld door de microtubuli-dynamiek te reguleren om de morfogenese correct te controleren. Een groot aantal moleculen die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van de microtubuli-activiteit is geïdentificeerd en gerelateerd onderzoek is nog steeds gaande3,4,28. Ons huidige begrip van de microtubuli-dynamiek in plantencellen verklaart de mechanismen van de organisatie van corticale microtubuli niet volledig. Hoewel zowel disopyramide als oryzaline microtubuli kunnen depolymeriseren, veroorzaakt disopyramide bijvoorbeeld ernstige wortelvervorming, terwijl oryzaline een relatief mild effect heeft. Bovendien veroorzaken mutaties in tubuline, dat microtubuli stabiliseert, ook dextrorotatie in wortels, terwijl paclitaxel, dat ook de microtubuli-dynamiek stabiliseert, dit niet doet. Het bestuderen en identificeren van de moleculaire doelwitten van ursolzuur zou daarom nieuwe inzichten moeten opleveren in de regulatie van microtubuli in de plantencortex. Evenzo zullen toekomstige vergelijkingen tussen chemicaliën die effectief zijn in het bevorderen van verstoorde groei, zoals disopyramide, en minder effectieve chemicaliën, zoals oryzaline of kumamotorzuur, aanwijzingen geven over hoe verstoorde groei ontstaat.
Aan de andere kant vormen aan verdediging gerelateerde veranderingen in het cytoskelet een andere mogelijke verklaring voor de cytotoxiciteit van ursonzuur. Infectie met een pathogeen of de introductie van een elicitor in plantencellen kan soms leiden tot vernietiging van het cytoskelet en daaropvolgende celdood29. Zo is bijvoorbeeld gerapporteerd dat cryptoxanthine, afkomstig van oomyceten, microtubuli en actinefilamenten verstoort vóór de celdood van tabakscellen, vergelijkbaar met wat er gebeurt bij behandeling met KAND30,31. De overeenkomsten tussen afweerreacties en cellulaire reacties die door ursonzuur worden geïnduceerd, brachten ons ertoe te veronderstellen dat ze gemeenschappelijke cellulaire processen in gang zetten, hoewel een sneller en sterker effect van ursonzuur dan van cryptoxanthine duidelijk is. Studies hebben echter aangetoond dat verstoring van actinefilamenten spontane celdood bevordert, die niet altijd gepaard gaat met verstoring van microtubuli29. Bovendien moet nog worden vastgesteld of het pathogeen of de elicitor een verstoorde wortelgroei veroorzaakt, zoals ursonzuurderivaten dat wel doen. Moleculaire kennis die afweerreacties en het cytoskelet met elkaar verbindt, is daarom een aantrekkelijk probleem om aan te pakken. Door gebruik te maken van de aanwezigheid van laagmoleculaire verbindingen verwant aan ursonzuur, evenals een reeks derivaten met uiteenlopende werkzaamheid, kunnen zij mogelijkheden bieden om onbekende cellulaire mechanismen te targeten.
Samengevat zullen de ontdekking en toepassing van nieuwe verbindingen die de microtubule-dynamiek moduleren, krachtige methoden opleveren om de complexe moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan de vormbepaling van plantencellen. In dit verband kan de recent ontwikkelde verbinding urmotonzuur, die microtubuli en actinefilamenten beïnvloedt en celdood induceert, een kans bieden om het verband tussen microtubule-regulatie en deze andere mechanismen te ontcijferen. Chemische en biologische analyses met behulp van urmotonzuur zullen ons dus helpen de moleculaire regulatiemechanismen te begrijpen die het cytoskelet van planten controleren.
Ent S. werraensis MK493-CF1 in een Erlenmeyerfles van 500 ml met schotten, gevuld met 110 ml kweekmedium bestaande uit 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence paste, 1% (w/v) Bacto composition-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maïsextract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 en 0,2% CaCO3 in gedemineraliseerd water (pH 7,4 vóór sterilisatie). De kweekculturen werden gedurende 2 dagen geïncubeerd op een schudapparaat (180 rpm) bij 27 °C. Productie via fermentatie in vaste fase. De entcultuur (7 ml) werd overgebracht naar een K-1 kolf van 500 ml met daarin 40 g productiemedium, bestaande uit 15 g geperste gerst (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g gedemineraliseerd water (pH niet aangepast vóór sterilisatie). De fermentatie werd gedurende 14 dagen bij 30 °C in het donker uitgevoerd. Het fermentatiemateriaal werd geëxtraheerd met 40 ml ethanol per fles en gecentrifugeerd (1500 g, 4 °C, 10 min). Het supernatant (60 ml) werd geëxtraheerd met een mengsel van 10% methanol/ethylacetaat. De organische laag werd onder verlaagde druk ingedampt om een residu (59,5 mg) te verkrijgen, dat werd onderworpen aan HPLC met gradiëntelutie (0–10 minuten: 90%) op een omgekeerde fasekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuten: 90% H2O/CH3CN tot 70% H2O/CH3CN (gradiënt), 35–45 minuten: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuten: 90% H2O/EtOH tot 100% EtOH (gradiënt), 155–200 min: 100% EtOH) bij een stroomsnelheid van 1,5 ml/min. Coumamonamide (1, 36,0 mg) werd geïsoleerd als een wit amorf poeder.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekende waarde: 141,0659, gemeten waarde: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-zaden (Col-0) werden verkregen van het Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) met toestemming voor onderzoeksdoeleinden. Col-0-zaden werden vermeerderd en onderhouden onder onze laboratoriumomstandigheden en gebruikt als wildtype Arabidopsis-planten. Arabidopsis-zaden werden aan het oppervlak gesteriliseerd en gekweekt in een halfsterk Murashige en Skoog-medium met 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)ethaansulfonzuur (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) en 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bij 23 °C en constant licht. Zaden van de phs1-1-mutant werden geleverd door T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Zaden van stam SR-1 werden geleverd door T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) en gebruikt als wilde tabaksplanten. Tabakszaden werden aan het oppervlak gesteriliseerd en drie nachten in steriel water geweekt om de kieming te bevorderen. Vervolgens werden ze in een halfsterke oplossing geplaatst die 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES en 0,8% gellangom (Fujifilm Wako Pure Chemical) bevatte (Murashige en Skoog-medium) met een pH van 5,7 en geïncubeerd bij 23 °C onder constant licht.
Stam Tak-1 werd geleverd door T. Kohchi (Kyoto Universiteit) en werd gebruikt als standaard experimentele eenheid voor het onderzoek naar levermos. Gemma werd verkregen uit gesteriliseerde gekweekte planten en vervolgens uitgeplaat op Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) met 1% sucrose en 0,3% gellangom en geïncubeerd bij 23 °C onder continu licht.
Tabak BY-2-cellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) werden geleverd door S. Hasezawa (Universiteit van Tokio). BY-2-cellen werden 95-voudig verdund in gemodificeerd Linsmeier en Skoog-medium en wekelijks aangevuld met 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur 32. De celsuspensie werd gemengd op een roterende schudmachine bij 130 tpm bij 27 °C in het donker. De cellen werden gewassen met 10 keer het volume vers medium en opnieuw gesuspendeerd in hetzelfde medium. BY-2-transgene cellijnen die stabiel de microtubulemarker TagRFP-TUA6 of de actinefilamentmarker GFP-ABD2 tot expressie brengen onder de bloemkoolmozaïekvirus 35S-promotor werden gegenereerd zoals beschreven33,34,35. Deze cellijnen kunnen worden onderhouden en gesynchroniseerd met behulp van procedures die vergelijkbaar zijn met die gebruikt voor de oorspronkelijke BY-2-cellijn.
HeLa-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) (Life Technologies) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1,2 U/ml penicilline en 1,2 μg/ml streptomycine in een incubator bij 37 °C met 5% CO2.
Alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Japanse bioveiligheidsvoorschriften en -richtlijnen.
De verbindingen werden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als stamoplossingen en verdund in MS-medium voor Arabidopsis en tabak of Gamborg B5-medium voor levermos. Voor de wortelgroeiremmingstest werden meer dan 10 zaden per plaat gezaaid op agarmedium met de aangegeven verbindingen of DMSO. De zaden werden 7 dagen in een klimaatkamer geïncubeerd. De zaailingen werden gefotografeerd en de lengte van de wortels werd gemeten. Voor de kiemingstest met Arabidopsis werden 48 zaden per plaat gezaaid op agarmedium met 200 μM van de verbinding of DMSO. De Arabidopsis-zaden werden in een klimaatkamer gekweekt en het aantal gekiemde zaailingen werd 7 dagen na de kieming geteld. Voor de kiemingstest met tabak werden 24 zaden per plaat gezaaid op agarmedium met 200 μM KAND of DMSO. Tabakszaden werden in een klimaatkamer gekweekt en het aantal ontkiemde zaailingen werd na 14 dagen geteld. Voor de groeiremmingstest met levermos werden 9 embryo's van elke plaat uitgeplaat op een agarmedium met de aangegeven concentraties KAND of DMSO en gedurende 14 dagen in een klimaatkamer geïncubeerd.
Gebruik zaailingen gekleurd met 5 mg/ml propidiumjodide (PI) om de organisatie van het wortelmeristeem te visualiseren. PI-signalen werden waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie met een TCS SPE confocale laserscanmicroscoop (Leica Microsystems).
Histochemische kleuring van wortels met β-glucuronidase (GUS) werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven door Malami en Benfey36. Zaailingen werden een nacht gefixeerd in 90% aceton, gekleurd met 0,5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronzuur in GUS-buffer gedurende 1 uur en geplaatst in een gehydrateerde chlooraldehyde-oplossing (8 g chloorhydraat, 2 ml water en 1 ml glycerol) en geobserveerd met behulp van differentieel interferentiecontrastmicroscopie met een Axio Imager M1-microscoop (Carl Zeiss).
De wortelhoeken werden gemeten bij 7 dagen oude zaailingen die op verticaal geplaatste platen groeiden. Meet de hoek van de wortel ten opzichte van de richting van de zwaartekrachtvector zoals beschreven in stap 6.
De rangschikking van corticale microtubuli werd waargenomen zoals beschreven, met kleine aanpassingen aan protocol 37. Anti-β-tubuline-antilichaam (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-muis IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) werden gebruikt als primaire en secundaire antilichamen in verdunningen van respectievelijk 1:1000 en 1:100. Fluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een TCS SPE confocale laserscanmicroscoop (Leica Microsystems). Z-stack-beelden werden verkregen en maximale intensiteitsprojecties werden gemaakt volgens de instructies van de fabrikant.
De proliferatietest voor HeLa-cellen werd uitgevoerd met behulp van de Cell Counting Kit 8 (Dojindo) volgens de instructies van de fabrikant.
De groei van E. coli DH5α werd geanalyseerd door de celdichtheid in de kweek te meten met behulp van een spectrofotometer bij 600 nm (OD600).
De cytoskeletale organisatie in transgene BY-2-cellen werd waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CSU-X1 confocale scaninrichting (Yokogawa) en een sCMOS-camera (Zyla, Andor Technology). De cytoskeletale dichtheid werd beoordeeld door middel van beeldanalyse, waarbij het percentage cytoskeletale pixels ten opzichte van cytoplasmatische pixels in confocale beelden werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software zoals beschreven38,39.
Om celdood in BY-2-cellen te detecteren, werd een aliquot van de celsuspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met 0,05% Evansblauw. Selectieve kleuring van dode cellen met Evansblauw is afhankelijk van de extrusie van de kleurstof uit levensvatbare cellen door het intacte plasmamembraan40. Gekleurde cellen werden geobserveerd met behulp van een helderveldmicroscoop (BX53, Olympus).
HeLa-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37°C en 5% CO2. De cellen werden gedurende 6 uur bij 37°C behandeld met 100 μM KAND 11, kumamonaminezuur 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco) of 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma). De cellen werden gedurende 10 minuten gefixeerd met methanol en vervolgens gedurende 5 minuten met acetaat bij kamertemperatuur. De gefixeerde cellen werden gedurende 2 uur geïncubeerd met een primair β-tubuline-antilichaam (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdund in 0,5% BSA/PBS, driemaal gewassen met TBST en vervolgens gedurende 1 uur geïncubeerd met een Alexa Fluor geitenantilichaam. – Muizen-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in 0,5% BSA/PBS. Na driemaal wassen met TBST werden de gekleurde cellen bekeken onder een Nikon Eclipse Ti-E omgekeerde microscoop. Beelden werden vastgelegd met een gekoelde Hamamatsu ORCA-R2 CCD-camera met behulp van MetaMorph-software (Molecular Devices).
Geplaatst op: 17 juni 2024