Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com.De browserversie die u gebruikt, heeft beperkte CSS-ondersteuning.Voor de beste resultaten raden wij u aan een nieuwere versie van uw browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen).Om voortdurende ondersteuning te garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijl of JavaScript.
De ontdekking en het nuttige gebruik van natuurlijke producten kunnen het menselijk leven helpen verbeteren.Plantengroeiremmende chemicaliën worden op grote schaal gebruikt als herbiciden om onkruid te bestrijden.Vanwege de noodzaak om verschillende soorten herbiciden te gebruiken, is er behoefte aan het identificeren van verbindingen met nieuwe werkingsmechanismen.In deze studie ontdekten we een nieuwe N-alkoxypyrroolverbinding, coumamonamide, van Streptomyces werraensis MK493-CF1 en stelden we het volledige syntheseproces vast.Door middel van testen op biologische activiteit ontdekten we dat urs-monoaminezuur een synthetisch tussenproduct is van urs-monoamide en een potentiëleplantengroeiremmer.Daarnaast hebben we verschillende urbenonzuurderivaten ontwikkeld, waaronder het urbenyloxyderivaat (UDA), dat een hoge herbicide activiteit heeft zonder de groei van HeLa-cellen negatief te beïnvloeden.We ontdekten ook dat urmotonzuurderivaten de microtubuli van planten verstoren;bovendien beïnvloedt KAND actinefilamenten en induceert celdood;Deze veelzijdige effecten verschillen van die van bekende microtubulusremmers en suggereren een nieuw werkingsmechanisme voor ursonzuur, wat een belangrijk voordeel vertegenwoordigt bij de ontwikkeling van nieuwe herbiciden.
De ontdekking en praktische toepassing van nuttige natuurlijke producten en hun derivaten is een manier om de kwaliteit van het menselijk leven te verbeteren.Secundaire metabolieten geproduceerd door micro-organismen, planten en insecten hebben geleid tot grote vooruitgang in de geneeskunde en de landbouw.Veel antibiotica en medicijnen tegen leukemie zijn ontwikkeld op basis van natuurlijke producten.Daarnaast diverse soortenpesticidenUit deze natuurlijke producten worden fungiciden en herbiciden gewonnen voor gebruik in de landbouw.Met name herbiciden voor onkruidbestrijding zijn belangrijke hulpmiddelen voor het verhogen van de gewasopbrengsten in de moderne landbouw, en verschillende soorten verbindingen worden al commercieel gebruikt.Verschillende cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese, aminozuurmetabolisme, celwandsynthese, regulatie van mitose, fytohormoonsignalering of eiwitsynthese, worden beschouwd als typische doelwitten van herbiciden.Verbindingen die de functie van microtubuli remmen zijn een veel voorkomende klasse van herbiciden die de plantengroei beïnvloeden door de mitotische regulatie te beïnvloeden2.
Microtubuli zijn componenten van het cytoskelet en worden op grote schaal geconserveerd in eukaryotische cellen.Het tubuline-heterodimeer bestaat uit α-tubuline en β-tubuline die lineaire microtubuli-protofilamenten vormen, waarbij 13 protofilamenten een cilindrische structuur vormen.Microtubuli spelen meerdere rollen in plantencellen, waaronder het bepalen van de celvorm, celdeling en intracellulair transport3,4.Plantencellen bevatten microtubuli onder het interfase-plasmamembraan, en er wordt aangenomen dat deze zogenaamde corticale microtubuli de organisatie van cellulosemicrofibrillen controleren door de regulatie van cellulosesynthasecomplexen4,5.Corticale microtubuli van epidermale wortelcellen, aanwezig in de zone van snelle verlenging van de wortelpunt, bevinden zich lateraal, en microvezels van cellulose volgen deze microtubuli en beperken de richting van celexpansie, waardoor anisotrope celverlenging wordt bevorderd.Daarom is de functie van microtubuli nauw verwant aan de plantenmorfologie.Aminozuursubstituties in genen die voor tubuline coderen, veroorzaken een scheeftrekking van de corticale microtubuli-arrays en links- of rechtszijdige groei in Arabidopsis 6,7.Op dezelfde manier kunnen mutaties in microtubuli-geassocieerde eiwitten die de dynamiek van microtubuli reguleren ook leiden tot verstoorde wortelgroei8,9,10,11,12,13.Bovendien veroorzaakt behandeling met microtubuli-verstorende herbiciden zoals disopyramide, ook bekend als pretilachloor, ook linkszijdige schuine wortelgroei14.Deze gegevens geven aan dat nauwkeurige regulatie van de microtubulifunctie van cruciaal belang is voor het bepalen van de richting van plantengroei.
Er zijn verschillende soorten microtubulusremmers ontdekt, en deze medicijnen hebben een belangrijke bijdrage geleverd aan onderzoek naar het cytoskelet, maar ook aan de landbouw en de geneeskunde2.In het bijzonder kunnen oryzalin, dinitroanilineverbindingen, disopyramide, benzamide-gerelateerde verbindingen en hun analogen de functie van microtubuli remmen en daardoor de plantengroei remmen.Daarom worden ze veel gebruikt als herbiciden.Omdat microtubuli echter een belangrijk onderdeel zijn van planten- en dierencellen, zijn de meeste microtubuli-remmers cytotoxisch voor beide celtypen.Daarom wordt, ondanks hun erkende nut als herbiciden, een beperkt aantal antimicrotubulimiddelen voor praktische doeleinden gebruikt.
Streptomyces is een geslacht van de familie Streptomyces, dat aerobe, grampositieve, draadvormige bacteriën omvat en algemeen bekend staat om zijn vermogen om een breed scala aan secundaire metabolieten te produceren.Daarom wordt het beschouwd als een van de belangrijkste bronnen van nieuwe biologisch actieve natuurlijke producten.In de huidige studie ontdekten we een nieuwe verbinding genaamd coumamonamide, die werd geïsoleerd uit Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Met behulp van spectrale analyse en volledige spectrale analyse werd de structuur van coumamonamide gekarakteriseerd en zijn unieke N-alkoxypyrrool-skelet was vastberaden.synthese.Ursmonzuur, een synthetisch tussenproduct van ursmonoamide en zijn derivaten, bleek de groei en kieming van de populaire modelplant Arabidopsis thaliana te remmen.In een structuur-activiteitsrelatieonderzoek hebben we ontdekt dat een verbinding met C9 gemodificeerd tot ursonzuur, genaamd nonyloxyderivaat van ursonzuur (KAND), het remmende effect op de groei en kieming aanzienlijk versterkt.Opvallend is dat de nieuw ontdekte plantengroeiremmer ook de groei van tabak en levermos beïnvloedde en niet cytotoxisch was voor bacteriën of HeLa-cellen.Bovendien veroorzaken sommige urmotonzuurderivaten een verstoord wortelfenotype, wat impliceert dat deze derivaten direct of indirect microtubuli beïnvloeden.In overeenstemming met dit idee geven onze waarnemingen van microtubuli die ofwel immunohistochemisch ofwel met fluorescerende eiwitten zijn gelabeld, aan dat KAND-behandeling microtubuli depolymeriseert.Bovendien verstoorde de behandeling met kumamotonzuurderivaten de actinemicrofilamenten.Zo hebben we een nieuwe plantengroeiremmer ontdekt waarvan het unieke werkingsmechanisme de vernietiging van het cytoskelet inhoudt.
Stam MK493-CF1 werd geïsoleerd uit grond in Shinagawa-ku, Tokio.Stam MK493-CF1 vormde goed vertakt stromaal mycelium.De gedeeltelijke sequentie van het 16S ribosomaal RNA-gen (1422 bp) werd bepaald.Deze stam lijkt sterk op S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typische stam, 99,93%).Op basis van dit resultaat werd vastgesteld dat deze stam nauw verwant was aan het type stam van S. werraensis.Daarom hebben we deze stam voorlopig S. werraensis MK493-CF1 genoemd.S. werraensis ISP 5486T produceert ook dezelfde bioactieve stoffen.Omdat er aanvankelijk weinig onderzoek was naar het verkrijgen van natuurlijke producten uit dit micro-organisme, werd verder chemisch onderzoek uitgevoerd.Na kweken van S. werraensis MK493-CF1 op gerstmedium door middel van fermentatie in vaste toestand bij 30°C gedurende 14 dagen, werd het medium geëxtraheerd met 50% EtOH.60 ml monster werd gedroogd, waardoor 59,5 mg ruw extract werd verkregen.Het ruwe extract werd onderworpen aan omgekeerde fase HPLC, wat N-methoxy-1H-pyrrool-2-carboxamide (1, genaamd coumamonamide, 36,0 mg) opleverde.De totale hoeveelheid van 1 is ongeveer 60% van het ruwe extract.Daarom hebben we besloten de eigenschappen van kumamotoamide 1 in detail te bestuderen.
Coumamonamide 1 is een wit amorf poeder en massaspectrometrie met hoge resolutie (HRESIMS) bevestigt C6H8N2O2 (Fig. 1).Het C2-gesubstitueerde pyrroolfragment van deze verbinding wordt gekenmerkt door δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH in 1H NMR-spectrum: 4,5 Hz , H-5) en 8H 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), en het 13C NMR-spectrum toont de aanwezigheid van vier sp2-koolstofatomen.De aanwezigheid van een amidegroep op de C2-positie werd beoordeeld door HMBC-correlatie van het C-3-proton met de amidecarbonylkoolstof bij 8C 161,1.Bovendien duiden 1H- en 13C-NMR-pieken bij 8H 4,10 (3H, S) en 8C 68,3 op de aanwezigheid van N-methoxygroepen in het molecuul.Hoewel de juiste positie van de methoxygroep nog niet was bepaald met behulp van spectroscopische analyses zoals verbeterde verschilspectroscopie en nucleaire Overhauser-afkorting (NOEDF), werd N-methoxy-1H-pyrrool-2-carboxamide de eerste kandidaatverbinding.
Om de juiste structuur van 1 te bepalen, werd een totale synthese uitgevoerd (Fig. 2a).Behandeling van in de handel verkrijgbaar 2-aminopyridine 2 met m-CPBA resulteerde in het overeenkomstige N-oxide 3 in kwantitatieve opbrengst.Na de 2-aminoazidatie van 2 werd de door Abramovich beschreven cyclocondensatiereactie uitgevoerd in benzeen bij 90°C om het gewenste 1-hydroxy-1H-pyrrool-2-carbonitril 5 in grammen te verkrijgen.Snelheid 60% (twee fasen).15,16.Methylering en hydrolyse van 4 leverde vervolgens 1-methoxy-1H-pyrrool-2-carbonzuur op (aangeduid als "cumotonzuur", 6) met goede opbrengst (70%, twee stappen).Tenslotte leverde amidering via zuurchloride-tussenproduct 6 met behulp van waterige ammoniak Kumamoto-amide 1 op met een opbrengst van 98%.Alle spectrale gegevens van gesynthetiseerd 1 waren vergelijkbaar met geïsoleerd 1, dus de structuur van 1 werd bepaald;
Algemene synthese en analyse van de biologische activiteit van urbenamide en urbeenzuur.(a) Totale synthese van Kumamoto-amide.(b) Zeven dagen oude wildtype Arabidopsis Columbia (Col) zaailingen werden gekweekt op Murashige en Skoog (MS) platen die coumamonamide 6 of coumamonamide 1 bevatten in de aangegeven concentraties.Schaalbalk = 1 cm.
Eerst hebben we de biologische activiteiten van urbenamide en zijn tussenproducten beoordeeld op hun vermogen om de plantengroei te moduleren.We voegden verschillende concentraties ursmonamide 1 of ursmonzuur 6 toe aan MS-agarmedium en kweekten Arabidopsis thaliana-zaailingen op dit medium.Deze testen toonden aan dat hoge concentraties (500 μM) van 6 de wortelgroei remden (Fig. 2b).Vervolgens hebben we verschillende derivaten gegenereerd door de N1-positie van 6 te vervangen en hebben we structuur-activiteitsrelatiestudies daarop uitgevoerd (het analoge syntheseproces wordt beschreven in de ondersteunende informatie (SI)).Arabidopsis-zaailingen werden gekweekt op een medium dat 50 μM ursonzuurderivaten bevatte, en de wortellengte werd gemeten.zoals op de foto te zien is.Zoals weergegeven in de figuren 3a, b en S1 hebben coumamozuren verschillende lengtes van lineaire alkoxyketens (9, 10, 11, 12 en 13) of grote alkoxyketens (15, 16 en 17) op de N1-positie.De derivaten vertoonden een significante remming van de wortelgroei.Bovendien ontdekten we dat de toepassing van 200 μM 10, 11 of 17 de kieming remde (figuren 3c en S2).
Studie van de structuur-activiteitsrelatie van Kumamoto-amide en verwante verbindingen.(a) Structuur en syntheseschema van analogen.(b) Kwantificering van de wortellengte van 7 dagen oude zaailingen gekweekt op MS-medium met of zonder 50 μM coumamonamidederivaten.Sterretjes geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (t-test, p<0,05).n>18. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD.nt betekent “niet getest” omdat meer dan 50% van de zaden niet ontkiemde.(c) Kwantificering van de kiemkracht van behandelde zaden die gedurende 7 dagen zijn geïncubeerd in MS-medium met of zonder 200 μM coumamonamide en verwante verbindingen.Sterretjes geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (chikwadraattest).n=96.
Interessant is dat de toevoeging van alkylzijketens langer dan C9 de remmende activiteit verminderde, wat suggereert dat aan kumamotoïnezuur gerelateerde verbindingen zijketens van een bepaalde grootte nodig hebben om hun biologische activiteit te vertonen.
Omdat analyse van de structuur-activiteitsrelatie aantoonde dat C9 was gemodificeerd tot ursonzuur en het nonyloxyderivaat van ursonzuur (hierna KAND 11 genoemd) de meest effectieve plantengroeiremmer was, hebben we een meer gedetailleerde karakterisering van KAND 11 uitgevoerd. met 50 μM KAND 11 voorkwam kieming bijna volledig, terwijl lagere concentraties (40, 30, 20 of 10 μM) KAND 11 de wortelgroei op een dosisafhankelijke manier remden (Fig. 4a, b).Om te testen of KAND 11 de levensvatbaarheid van het wortelmeristeem beïnvloedt, onderzochten we wortelmeristemen gekleurd met propidiumjodide (PI) en maten we de grootte van het meristeemgebied.De grootte van het meristeem van zaailingen gekweekt op een medium dat 25 μM KAND-11 bevat, was 151,1 ± 32,5 μm, terwijl de grootte van het meristeem van zaailingen gekweekt op een controlemedium dat DMSO bevatte 264,7 ± 30,8 μm was (Fig. 4c, d) , wat aangeeft dat KAND-11 de cellulaire activiteit herstelt.verspreiden.Wortelmeristeem.In overeenstemming hiermee verminderde de KAND 11-behandeling de hoeveelheid celdelingsmarker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signaal in het wortelmeristeem (Fig. 4e) 17 .Deze resultaten geven aan dat KAND 11 de wortelgroei remt door de celproliferatie-activiteit te verminderen.
Analyse van het remmende effect van urbenonzuurderivaten (urbenyloxyderivaten) op de groei.(a) 7 dagen oude wildtype Col-zaailingen gekweekt op MS-platen met de aangegeven concentraties KAND 11. Schaalbalk = 1 cm.(b) Kwantificering van de wortellengte.Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p<0,05).n>16. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD.(c) Confocale microscopie van met propidiumjodide gekleurde wildtype Col-wortels gekweekt op MS-platen met of zonder 25 μM KAND 11. Witte haakjes geven wortelmeristeem aan.Schaalbalk = 100 µm.(d) Kwantificering van de grootte van het wortelmeristeem (n = 10 tot 11).Statistische verschillen werden bepaald met behulp van de t-test (p<0,05).De balken vertegenwoordigen de gemiddelde meristeemgrootte.(e) Differentiële interferentiecontrast (DIC) microscopie van een wortelmeristeem dat het CDKB2-construct bevat;1pro: CDKB2;1-GUS gekleurd en gekleurd op 5 dagen oude zaailingen gekweekt op MS-platen met of zonder 25 µM KAND-test.
De fytotoxiciteit van KAND 11 werd verder getest met behulp van een andere tweezaadlobbige plant, tabak (Nicotiana tabacum), en een belangrijk modelorganisme voor een landplant, levermos (Marchantia polymorpha).Net als in het geval van Arabidopsis produceerden tabaks-SR-1-zaailingen gekweekt op medium dat 25 μM KAND 11 bevatte kortere wortels (Fig. 5a).Bovendien ontkiemden 40 van de 48 zaden op platen die 200 μM KAND 11 bevatten, terwijl alle 48 zaden ontkiemden op nep-behandelde media, wat aangeeft dat hogere concentraties KAND significant waren (p< 0,05;chi-test -kwadraat) remde de kieming van tabak.(Afb. 5b).Bovendien was de concentratie van KAND 11 die de bacteriegroei in levermos remde vergelijkbaar met de effectieve concentratie in Arabidopsis (Fig. 5c).Deze resultaten geven aan dat KAND 11 de groei van een verscheidenheid aan planten kan remmen.Vervolgens onderzochten we de mogelijke cytotoxiciteit van beer-monoamide-gerelateerde verbindingen in andere organismen, namelijk menselijke HeLa-cellen en Escherichia coli-stam DH5α, als vertegenwoordigers van respectievelijk hogere dierlijke en bacteriële cellen.In een reeks celproliferatietests hebben we waargenomen dat coumamonamide 1, coumamonamidezuur 6 en KAND 11 de groei van HeLa- of E. coli-cellen niet beïnvloedden bij concentraties van 100 μM (Fig. 5d, e).
Groeiremming van KAND 11 in niet-Arabidopsis-organismen.(a) Twee weken oude wildtype SR-1-tabakszaailingen werden gekweekt op verticaal geplaatste MS-platen die 25 μM KAND 11 bevatten. (b) Twee weken oude wildtype SR-1-tabakszaailingen werden gekweekt op horizontaal geplaatste MS-platen die 200 μM KAND 11 bevatten. ( c) Twee weken oude wildtype Tak-1-levermosknoppen gekweekt op Gamborg B5-platen met de aangegeven concentraties KAND 11. Rode pijlen geven sporen aan die stopten met groeien binnen de incubatie van twee weken periode.(d) Celproliferatietest van HeLa-cellen.Het aantal levensvatbare cellen werd op vaste tijdsintervallen gemeten met behulp van een celtelkit 8 (Dojindo).Ter controle werden HeLa-cellen behandeld met 5 μg / ml actinomycine D (Act D), dat de transcriptie van RNA-polymerase remt en celdood veroorzaakt.Analyses werden in drievoud uitgevoerd.(e) E. coli-celproliferatietest.De groei van E. coli werd geanalyseerd door het meten van OD600.Ter controle werden de cellen behandeld met 50 μg/ml ampicilline (Amp), dat de bacteriële celwandsynthese remt.Analyses werden in drievoud uitgevoerd.
Om het werkingsmechanisme van cytotoxiciteit veroorzaakt door uramide-gerelateerde verbindingen te ontcijferen, hebben we urbeenzuurderivaten met matige remmende effecten opnieuw geanalyseerd.zoals op de foto te zien is.Zoals weergegeven in figuren 2b en 6a produceerden zaailingen gekweekt op agarplaten met hoge concentraties (200 μM) urmotonzuur 6 kortere en naar links gebogen wortels (θ = – 23,7 ± 6,1), terwijl van zaailingen gekweekt op het controlemedium de zaailingen produceerden vrijwel rechte wortels (θ = – 3,8 ± 7,1).Het is bekend dat deze karakteristieke schuine groei het gevolg is van disfunctie van corticale microtubuli14,18.In overeenstemming met deze bevinding induceerden de microtubuli-destabiliserende geneesmiddelen disopyramide en oryzalin een soortgelijke wortelkanteling onder onze groeiomstandigheden (figuren 2b, 6a).Tegelijkertijd hebben we urmotonzuurderivaten getest en er een aantal geselecteerd die, bij bepaalde concentraties, schuine wortelgroei induceerden.Verbindingen 8, 9 en 15 veranderden de richting van wortelgroei bij respectievelijk 75 μM, 50 μM en 40 μM, wat aangeeft dat deze verbindingen microtubuli effectief kunnen destabiliseren (Fig. 2b, 6a).We hebben ook het krachtigste ursolinezuurderivaat, KAND 11, getest bij een lagere concentratie (15 µM) en ontdekten dat de toepassing van KAND 11 de wortelgroei remde en dat de richting van de wortelgroei ongelijk was, hoewel ze de neiging hadden naar links te hellen ( Figuur C3)..Omdat hogere concentraties van microtubuli-destabiliserende medicijnen soms de plantengroei remmen in plaats van het kantelen van de wortels te veroorzaken, hebben we vervolgens de mogelijkheid onderzocht dat KAND 11 microtubuli beïnvloedt door corticale microtubuli in wortelepidermale cellen te observeren.Immunohistochemie met behulp van anti-β-tubuline-antilichamen in epidermale cellen van zaailingwortels behandeld met 25 μM KAND 11 toonde de verdwijning aan van bijna alle corticale microtubuli in epidermale cellen in de verlengingszone (Fig. 6b).Deze resultaten geven aan dat kumamotonzuur en zijn derivaten direct of indirect inwerken op microtubuli om deze te verstoren en dat deze verbindingen nieuwe microtubuli-remmers zijn.
Ursonzuur en zijn derivaten veranderen corticale microtubuli in Arabidopsis thaliana.(a) Wortelhellingshoek gemeten in aanwezigheid van verschillende urmotonzuurderivaten bij de aangegeven concentraties.De effecten van twee verbindingen waarvan bekend is dat ze microtubuli remmen: disopyramide en oryzalin werden ook geanalyseerd.De inzet toont de standaard die wordt gebruikt om de wortelgroeihoek te meten.Sterretjes geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (t-test, p<0,05).n>19. Schaalbalk = 1 cm.(b) Corticale microtubuli in epidermale cellen in de verlengingszone.Microtubuli in wildtype Arabidopsis Col-wortels gekweekt op MS-platen met of zonder 25 μM KAND 11 werden zichtbaar gemaakt door immunohistochemische kleuring met behulp van primaire β-tubuline-antilichamen en Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen.Schaalbalk = 10 µm.(c) Mitotische structuur van microtubuli in het wortelmeristeem.Microtubuli werden zichtbaar gemaakt met behulp van immunohistochemische kleuring.Mitotische structuren, inclusief profasezones, spindels en phragmoplasten, werden geteld uit confocale beelden.Pijlen geven mitotische microtubuli-structuren aan.Sterretjes geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (t-test, p<0,05).n>9. Schaalbalk = 50 µm.
Hoewel Ursa het vermogen heeft om de functie van microtubuli te verstoren, wordt verwacht dat het werkingsmechanisme ervan verschilt van dat van typische depolymeriserende middelen voor microtubuli.Hogere concentraties microtubuli-depolymeriserende middelen zoals disopyramide en oryzalin induceren bijvoorbeeld anisotrope expansie van epidermale cellen, terwijl KAND 11 dat niet doet.Bovendien resulteerde gelijktijdige toepassing van KAND 11 en disopyramide in een gecombineerde, door disopyramide geïnduceerde wortelgroeireactie en werd door KAND 11 geïnduceerde groeiremming waargenomen (Fig. S4).We analyseerden ook de reactie van de overgevoelige disopyramide 1-1 (phs1-1)-mutant op KAND 11. phs1-1 heeft een niet-canonieke tubulinekinasepuntmutatie en produceert kortere wortels bij behandeling met disopyramide9,20.Phs1-1-mutante zaailingen gekweekt op agarmedium dat KAND 11 bevatte, hadden kortere wortels vergelijkbaar met die gekweekt op disopyramide (fig. S5).
Daarnaast hebben we mitotische microtubuli-structuren waargenomen, zoals profasezones, spindels en phragmoplasten, in het wortelmeristeem van zaailingen behandeld met KAND 11. In overeenstemming met de waarnemingen voor CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS werd een significante afname in het aantal mitotische microtubuli werd waargenomen (Fig. .6c).
Om de cytotoxiciteit van KAND 11 bij subcellulaire resolutie te karakteriseren, behandelden we BY-2-suspensiecellen van tabak met KAND 11 en observeerden we hun reactie.We hebben eerst KAND 11 toegevoegd aan BY-2-cellen die TagRFP-TUA6 tot expressie brengen, dat microtubuli fluorescent labelt, om het effect van KAND 11 op corticale microtubuli te beoordelen.De dichtheid van corticale microtubuli werd beoordeeld met behulp van beeldanalyse, die het percentage cytoskeletpixels onder cytoplasmatische pixels kwantificeerde.De testresultaten toonden aan dat na behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 gedurende 1 uur de dichtheid aanzienlijk daalde tot respectievelijk 0,94 ± 0,74% of 0,23 ± 0,28%, terwijl de dichtheid van cellen behandeld met DMSO 1,61 ± 0,34 bedroeg. % (Fig. 7a).Deze resultaten komen overeen met de waarneming in Arabidopsis dat behandeling met KAND 11 depolymerisatie van corticale microtubuli induceert (Fig. 6b).We onderzochten ook de BY-2-lijn met GFP-ABD-gelabelde actinefilamenten na behandeling met dezelfde concentratie KAND 11 en observeerden dat behandeling met KAND 11 de actinefilamenten verstoorde.Behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 gedurende 1 uur verminderde de actinefilamentdichtheid aanzienlijk tot respectievelijk 1,20 ± 0,62% of 0,61 ± 0,26%, terwijl de dichtheid in met DMSO behandelde cellen 1,69 ± 0,51% was (Fig. 2).7b).Deze resultaten staan in contrast met de effecten van propyzamide, dat de actinefilamenten niet aantast, en latrunculine B, een actine-depolymerisator die de microtubuli niet aantast (SI Figuur S6).Bovendien had de behandeling met coumamonamide 1, coumamonamidezuur 6 of KAND 11 geen invloed op de microtubuli in HeLa-cellen (SI Figuur S7).Er wordt dus aangenomen dat het werkingsmechanisme van KAND 11 verschilt van dat van bekende cytoskeletontregelaars.Bovendien onthulde onze microscopische observatie van BY-2-cellen behandeld met KAND 11 het begin van celdood tijdens KAND 11-behandeling en toonde aan dat het aandeel Evans-blauw gekleurde dode cellen niet significant toenam na 30 minuten KAND 11-behandeling, terwijl na 90 minuten behandeling met 50 μM of 100 μM KAND nam het aantal dode cellen toe tot respectievelijk 43,7% of 80,1% (figuur 7c).Alles bij elkaar geven deze gegevens aan dat het nieuwe ursolinezuurderivaat KAND 11 een plantspecifieke cytoskeletremmer is met een voorheen onbekend werkingsmechanisme.
KAND beïnvloedt corticale microtubuli, actinefilamenten en de levensvatbaarheid van BY-2-cellen van tabak.(a) Visualisatie van corticale microtubuli in BY-2-cellen in aanwezigheid van TagRFP-TUA6.BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met confocale microscopie.De corticale microtubulidichtheid werd berekend op basis van microfoto's van 25 onafhankelijke cellen.Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p<0,05).Schaalbalk = 10 µm.(b) Corticale actinefilamenten in BY-2-cellen zichtbaar gemaakt in de aanwezigheid van GFP-ABD2.BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met confocale microscopie.De dichtheid van corticale actinefilamenten werd berekend uit microfoto's van 25 onafhankelijke cellen.Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p<0,05).Schaalbalk = 10 µm.(c) Observatie van dode BY-2-cellen door Evans-blauwkleuring.BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met helderveldmicroscopie.n=3.Schaalbalk = 100 µm.
De ontdekking en toepassing van nieuwe natuurlijke producten heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in verschillende aspecten van het menselijk leven, waaronder de geneeskunde en de landbouw.Er is historisch onderzoek uitgevoerd om nuttige verbindingen uit natuurlijke hulpbronnen te verkrijgen.In het bijzonder is bekend dat actinomyceten nuttig zijn als antiparasitaire antibiotica voor nematoden vanwege hun vermogen om verschillende secundaire metabolieten te produceren, zoals avermectine, de hoofdverbinding van ivermectine en bleomycine en zijn derivaten, die medicinaal worden gebruikt als middel tegen kanker21,22.Op dezelfde manier is er een verscheidenheid aan herbicide verbindingen ontdekt uit actinomyceten, waarvan sommige al commercieel worden gebruikt1,23.Daarom wordt de analyse van actinomycetenmetabolieten om natuurlijke producten met gewenste biologische activiteiten te isoleren als een effectieve strategie beschouwd.In deze studie hebben we een nieuwe verbinding, coumamonamide, uit S. werraensis ontdekt en deze met succes gesynthetiseerd.Ursonzuur is een synthetisch tussenproduct van urbenamide en zijn derivaten.Het kan karakteristieke wortelkrulling veroorzaken, een matige tot sterke herbicide activiteit vertonen en de microtubuli van planten direct of indirect beschadigen.Het werkingsmechanisme van urmotonzuur kan echter verschillen van dat van bestaande microtubuli-remmers, aangezien KAND 11 ook actinefilamenten verstoort en celdood veroorzaakt, wat duidt op een regulerend mechanisme waarmee urmotonzuur en zijn derivaten een breed scala aan cytoskeletstructuren beïnvloeden..
Verdere gedetailleerde karakterisering van urbenonzuur zal helpen het werkingsmechanisme van urbenonzuur beter te begrijpen.In het bijzonder is het volgende doel het evalueren van het vermogen van ursonzuur om zich te binden aan gereduceerde microtubuli om te bepalen of ursonzuur en zijn derivaten direct op microtubuli inwerken en deze depolymeriseren, of dat hun werking resulteert in destabilisatie van microtubuli.Bovendien, in het geval dat microtubuli geen direct doelwit zijn, zal het identificeren van de werkingsplaats en moleculaire doelwitten van ursonzuur op plantencellen helpen de eigenschappen van verwante verbindingen en mogelijke manieren om de herbicide activiteit te verbeteren verder te begrijpen.Onze bioactiviteitstest onthulde het unieke cytotoxische vermogen van ursonzuur op de groei van planten zoals Arabidopsis thaliana, tabak en levermos, terwijl noch E. coli noch HeLa-cellen werden aangetast.Weinig of geen toxiciteit voor dierlijke cellen is een voordeel van ursonzuurderivaten als ze worden ontwikkeld als herbiciden voor gebruik in open landbouwvelden.Omdat microtubuli veel voorkomende structuren zijn bij eukaryoten, is hun selectieve remming in planten een belangrijke vereiste voor herbiciden.Propyzamide, een depolymerisatiemiddel voor microtubuli dat zich direct aan tubuline bindt en de polymerisatie remt, wordt bijvoorbeeld als herbicide gebruikt vanwege de lage toxiciteit voor dierlijke cellen24.In tegenstelling tot disopyramide hebben verwante benzamiden verschillende doelspecificiteiten.Naast microtubuli van planten remt RH-4032 of benzoxamide ook microtubuli van respectievelijk dierlijke cellen of oomyceten, en zalilamide wordt gebruikt als fungicide vanwege de lage fytotoxiciteit ervan25,26,27.De nieuw ontdekte beer en zijn derivaten vertonen selectieve cytotoxiciteit tegen planten, maar het is de moeite waard om op te merken dat verdere modificaties hun doelspecificiteit kunnen veranderen, waardoor mogelijk aanvullende derivaten kunnen worden verkregen voor de bestrijding van pathogene schimmels of oomyceten.
De unieke eigenschappen van urbenonzuur en zijn derivaten zijn nuttig voor hun ontwikkeling als herbiciden en voor gebruik als onderzoeksinstrumenten.Het belang van het cytoskelet bij het beheersen van de vorm van plantencellen wordt algemeen erkend.Eerdere studies hebben aangetoond dat planten complexe mechanismen van de organisatie van corticale microtubuli hebben ontwikkeld door de dynamiek van microtubuli te beheersen om de morfogenese goed te beheersen.Er is een groot aantal moleculen geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van de activiteit van microtubuli, en gerelateerd onderzoek is nog steeds aan de gang3,4,28.Ons huidige begrip van de dynamiek van microtubuli in plantencellen verklaart de mechanismen van de corticale organisatie van microtubuli niet volledig.Hoewel zowel disopyramide als oryzalin bijvoorbeeld microtubuli kunnen depolymeriseren, veroorzaakt disopyramide bijvoorbeeld ernstige wortelvervorming, terwijl oryzalin een relatief mild effect heeft.Bovendien veroorzaken mutaties in tubuline, dat microtubuli stabiliseert, ook rechtsrotatie in de wortels, terwijl paclitaxel, dat ook de dynamiek van microtubuli stabiliseert, dat niet doet.Daarom zou het bestuderen en identificeren van de moleculaire doelwitten van ursolzuur nieuwe inzichten moeten opleveren in de regulatie van plantcorticale microtubuli.Op dezelfde manier zullen toekomstige vergelijkingen van chemicaliën die effectief zijn in het bevorderen van verstoorde groei, zoals disopyramide, en minder effectieve chemicaliën, zoals oryzalin of kumamotorzuur, aanwijzingen geven over hoe verstoorde groei optreedt.
Aan de andere kant zijn defensiegerelateerde herschikkingen van het cytoskelet een andere mogelijkheid om de cytotoxiciteit van ursonzuur te verklaren.Infectie van een pathogeen of introductie van een elicitor in plantencellen veroorzaakt soms vernietiging van het cytoskelet en daaropvolgende celdood29.Er is bijvoorbeeld gerapporteerd dat van oomyceten afgeleide cryptoxanthine microtubuli en actinefilamenten verstoort voorafgaand aan de dood van tabakscellen, vergelijkbaar met wat er gebeurt bij KAND-behandeling30,31.De overeenkomsten tussen afweerreacties en cellulaire reacties geïnduceerd door ursonzuur brachten ons tot de hypothese dat ze gemeenschappelijke cellulaire processen in gang zetten, hoewel een sneller en sterker effect van ursonzuur dan cryptoxanthine duidelijk is.Studies hebben echter aangetoond dat verstoring van actinefilamenten spontane celdood bevordert, wat niet altijd gepaard gaat met verstoring van microtubuli29.Bovendien valt nog te bezien of de ziekteverwekker of de opwekker een verstoorde wortelgroei veroorzaakt, zoals ursonzuurderivaten doen.Moleculaire kennis die de afweerreacties en het cytoskelet met elkaar verbindt, is dus een aantrekkelijk probleem dat moet worden aangepakt.Door gebruik te maken van de aanwezigheid van verbindingen met een laag molecuulgewicht die verband houden met ursonzuur, evenals van een reeks derivaten met verschillende potenties, kunnen ze mogelijkheden bieden om onbekende cellulaire mechanismen aan te pakken.
Alles bij elkaar genomen zal de ontdekking en toepassing van nieuwe verbindingen die de dynamiek van microtubuli moduleren krachtige methoden opleveren om de complexe moleculaire mechanismen aan te pakken die ten grondslag liggen aan de bepaling van de vorm van plantencellen.In deze context kan de recent ontwikkelde verbinding urmotonzuur, die microtubuli en actinefilamenten aantast en celdood induceert, een mogelijkheid bieden om het verband tussen de controle van microtubuli en deze andere mechanismen te ontcijferen.Chemische en biologische analyse met behulp van urbenonzuur zal ons dus helpen de moleculaire regulerende mechanismen te begrijpen die het cytoskelet van de plant controleren.
Inoculeer S. werraensis MK493-CF1 in een erlenmeyerkolf van 500 ml met 110 ml zaadmedium bestaande uit 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) Essence-pasta, 1% (w/v) Bacto-samenstelling .-sojaton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maïsextract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 en 0,2% CaCO3 in gedeïoniseerd water.(pH 7,4 vóór sterilisatie).De zaadculturen werden gedurende 2 dagen bij 27°C op een roterende schudinrichting (180 rpm) geïncubeerd.Productieteelt via solid-state fermentatie.De zaadcultuur (7 ml) werd overgebracht naar een K-1-kolf van 500 ml die 40 g productiemedium bevatte, bestaande uit 15 g geperste gerst (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g gedeïoniseerd water (pH niet aangepast vóór sterilisatie).).De fermentatie vond plaats bij 30°C in het donker gedurende 14 dagen.Het fermentatiemateriaal werd geëxtraheerd met 40 ml/fles EtOH en gecentrifugeerd (1500 g, 4°C, 10 min).Het kweeksupernatant (60 ml) werd geëxtraheerd met een mengsel van 10% MeOH/EtOAc.De organische laag werd onder verminderde druk ingedampt om een residu (59,5 mg) te verkrijgen, dat werd onderworpen aan HPLC met gradiëntelutie (0-10 minuten: 90%) op een omgekeerde fasekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuten: 90% H2O/CH3CN tot 70% H2O/CH3CN (gradiënt), 35–45 minuten: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuten: 90% H2O /EtOH tot 100% EtOH (gradiënt (gradiënt), 155–200 min: 100% EtOH) bij een stroomsnelheid van 1,5 ml/min werd coumamonamide (1, 36,0 mg) geïsoleerd als een wit amorf poeder.
Kumamotoamide(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) 8 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDC13) 8 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekende waarde: 141,0659, gemeten waarde: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-zaden (Col-0) werden verkregen van het Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) met toestemming voor onderzoeksgebruik.Col-0-zaden werden onder onze laboratoriumomstandigheden vermeerderd en in stand gehouden en gebruikt als wildtype Arabidopsis-planten.Arabidopsis-zaden werden aan het oppervlak gesteriliseerd en gekweekt in Murashige- en Skoog-medium van halve sterkte met 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)ethaansulfonzuur (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ).) en 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bij 23 °C en constant licht.Zaden van de phs1-1-mutant werden geleverd door T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Zaden van stam SR-1 werden geleverd door T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) en gebruikt als wildtype tabaksplanten.Tabakszaden werden aan het oppervlak gesteriliseerd en drie nachten in steriel water geweekt om de kieming te bevorderen, en vervolgens in een oplossing van halve sterkte geplaatst die 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES en 0,8% gellangom (Fujifilm Wako Pure Chemical) bevatte. Murashige.en Skoog-medium) met pH 5,7 en geïncubeerd bij 23°C onder constant licht.
Stam Tak-1 werd geleverd door T. Kohchi (Kyoto University) en werd gebruikt als de standaard experimentele eenheid voor het levermosonderzoek.Gemma werd verkregen uit gesteriliseerde gekweekte planten en vervolgens uitgeplaat op Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) dat 1% sucrose en 0,3% gellangom bevatte en bij 23°C onder continu licht geïncubeerd.
Tabak BY-2-cellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) werden geleverd door S. Hasezawa (Universiteit van Tokio).BY-2-cellen werden 95-voudig verdund in gemodificeerd Linsmeier- en Skoog-medium en wekelijks aangevuld met 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur 32.De celsuspensie werd gemengd op een roterende schudder bij 130 rpm bij 27°C in het donker.Was de cellen met 10 keer het volume vers medium en resuspendeer in hetzelfde medium.BY-2-transgene cellijnen die stabiel de microtubulusmarker TagRFP-TUA6 of de actinefilamentmarker GFP-ABD2 tot expressie brengen onder de 35S-promoter van het bloemkoolmozaïekvirus werden gegenereerd zoals beschreven .Deze cellijnen kunnen worden onderhouden en gesynchroniseerd met behulp van procedures die vergelijkbaar zijn met die voor de oorspronkelijke BY-2-cellijn.
HeLa-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) aangevuld met 10% foetaal runderserum, 1,2 U/ml penicilline en 1,2 μg/ml streptomycine in een incubator bij 37°C met 5% CO2.
Alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven, werden uitgevoerd in overeenstemming met de Japanse bioveiligheidsvoorschriften en richtlijnen.
Verbindingen werden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als voorraadoplossingen en verdund in MS-medium voor Arabidopsis en tabak of Gamborg B5-medium voor levermos.Voor de wortelgroeiremmingstest werden meer dan 10 zaden per plaat gezaaid op agarmedium dat de aangegeven verbindingen of DMSO bevatte.Zaden werden gedurende 7 dagen in een groeikamer geïncubeerd.De zaailingen werden gefotografeerd en de lengte van de wortels werd gemeten.Voor de ontkiemingstest van Arabidopsis werden 48 zaden per plaat gezaaid op agarmedium dat 200 μM verbinding of DMSO bevatte.Arabidopsis-zaden werden in een groeikamer gekweekt en het aantal ontkiemde zaailingen werd 7 dagen na ontkieming (dag) geteld.Voor de ontkiemingstest van tabak werden 24 zaden per plaat gezaaid op agarmedium dat 200 μM KAND of DMSO bevatte.Tabakszaden werden in een groeikamer gekweekt en na 14 dagen werd het aantal ontkiemde zaailingen geteld.Voor de test op remming van de groei van levermos werden 9 embryo's van elke plaat uitgeplaat op agarmedium dat de aangegeven concentraties KAND of DMSO bevatte en gedurende 14 dagen in een groeikamer geïncubeerd.
Gebruik zaailingen gekleurd met 5 mg/ml propidiumjodide (PI) om de wortelmeristeemorganisatie te visualiseren.PI-signalen werden waargenomen door middel van fluorescentiemicroscopie met behulp van een TCS SPE confocale laserscanmicroscoop (Leica Microsystems).
Histochemische kleuring van wortels met β-glucuronidase (GUS) werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven door Malami en Benfey36.Zaailingen werden gedurende de nacht gefixeerd in 90% aceton, gekleurd met 0,5 mg/ml 5-broom-4-chloor-3-indolyl-p-d-glucuronzuur in GUS-buffer gedurende 1 uur en in een gehydrateerde chlooraldehyde-oplossing geplaatst.(8 g chloraalhydraat, 2 ml water en 1 ml glycerol) en waargenomen door differentiële interferentiecontrastmicroscopie met behulp van een Axio Imager M1-microscoop (Carl Zeiss).
De wortelhoeken werden gemeten bij 7 dagen oude zaailingen gekweekt op verticaal geplaatste platen.Meet de hoek van de wortel vanuit de richting van de zwaartekrachtvector zoals beschreven in stap 6.
De rangschikking van corticale microtubuli werd waargenomen zoals beschreven, met kleine wijzigingen in het protocol 37 .Anti-β-tubuline antilichaam (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-muis IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) werden gebruikt als primaire en secundaire antilichamen bij verdunningen van 1:1000 en 1:100, respectievelijk.Fluorescentiebeelden werden verkregen met behulp van een TCS SPE confocale laserscanmicroscoop (Leica Microsystems).Verkrijg Z-stack-afbeeldingen en creëer projecties met maximale intensiteit volgens de instructies van de fabrikant.
HeLa-celproliferatietest werd uitgevoerd met behulp van Cell Counting Kit 8 (Dojindo) volgens de instructies van de fabrikant.
De groei van E. coli DH5a werd geanalyseerd door het meten van de celdichtheid in de kweek met behulp van een spectrofotometer bij 600 nm (OD600).
Cytoskeletorganisatie in transgene BY-2-cellen werd waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CSU-X1 confocaal scanapparaat (Yokogawa) en een sCMOS-camera (Zyla, Andor Technology).Cytoskeletdichtheid werd beoordeeld door beeldanalyse, waarbij het percentage cytoskeletpixels onder cytoplasmatische pixels in confocale beelden werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software zoals beschreven .
Om celdood in BY-2-cellen te detecteren, werd een portie van de celsuspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met 0,05% Evans-blauw.Selectieve Evans-blauwe kleuring van dode cellen hangt af van de extrusie van de kleurstof uit levensvatbare cellen door het intacte plasmamembraan.Gekleurde cellen werden waargenomen met behulp van een helderveldmicroscoop (BX53, Olympus).
HeLa-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37°C en 5% CO2.Cellen werden gedurende 6 uur bij 37 ° C behandeld met 100 μM KAND 11, kumamonaminezuur 6, kumamonamide 1, 100 ng / ml colcemid (Gibco) of 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma).Cellen werden 10 minuten gefixeerd met MetOH en vervolgens 5 minuten bij kamertemperatuur met acetaat.Gefixeerde cellen werden geïncubeerd met primair β-tubuline-antilichaam (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdund in 0,5% BSA/PBS gedurende 2 uur, driemaal gewassen met TBST en vervolgens geïncubeerd met Alexa Fluor-geit-antilichaam.488 1 uur.– IgG van muis (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in 0,5% BSA/PBS.Na driemaal wassen met TBST werden gekleurde cellen waargenomen op een Nikon Eclipse Ti-E omgekeerde microscoop.Beelden werden vastgelegd met een gekoelde Hamamatsu ORCA-R2 CCD-camera met behulp van MetaMorph-software (Molecular Devices).
Posttijd: 17 juni 2024