Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte CSS-ondersteuning. Voor de beste resultaten raden we u aan een nieuwere versie van uw browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder styling of JavaScript.
De ontdekking en het nuttige gebruik van natuurlijke producten kunnen het menselijk leven verbeteren. Chemische stoffen die de plantengroei remmen, worden veel gebruikt als herbiciden om onkruid te bestrijden. Omdat er verschillende soorten herbiciden nodig zijn, is er behoefte aan de identificatie van stoffen met nieuwe werkingsmechanismen. In deze studie ontdekten we een nieuwe N-alkoxypyrroolverbinding, coumamonamide, afkomstig van Streptomyces werraensis MK493-CF1, en stelden we het volledige syntheseproces vast. Door middel van biologische activiteitstests ontdekten we dat urs-monoaminezuur een synthetisch tussenproduct is van urs-monoamide en een potentiëleplantengroeiremmerDaarnaast hebben we verschillende derivaten van urbenonzuur ontwikkeld, waaronder het urbenyloxyderivaat (UDA), dat een hoge herbicide werking heeft zonder de groei van HeLa-cellen negatief te beïnvloeden. We ontdekten ook dat derivaten van urmonzuur de microtubuli van planten verstoren; bovendien beïnvloedt KAND actinefilamenten en induceert celdood; deze veelzijdige effecten verschillen van die van bekende microtubuli-remmers en suggereren een nieuw werkingsmechanisme voor ursonzuur, wat een belangrijk voordeel is bij de ontwikkeling van nieuwe herbiciden.
De ontdekking en praktische toepassing van heilzame natuurlijke producten en hun derivaten is een manier om de kwaliteit van het menselijk leven te verbeteren. Secundaire metabolieten, geproduceerd door micro-organismen, planten en insecten, hebben geleid tot grote vooruitgang in de geneeskunde en landbouw. Veel antibiotica en geneesmiddelen tegen leukemie zijn ontwikkeld op basis van natuurlijke producten. Daarnaast zijn er verschillende soortenpesticidenUit deze natuurlijke producten worden fungiciden en herbiciden gewonnen voor gebruik in de landbouw. Met name onkruidbestrijdingsmiddelen zijn belangrijke hulpmiddelen voor het verhogen van de gewasopbrengsten in de moderne landbouw, en verschillende soorten verbindingen worden al commercieel gebruikt. Verschillende cellulaire processen in planten, zoals fotosynthese, aminozuurmetabolisme, celwandsynthese, regulering van de mitose, fytohormoonsignalering of eiwitsynthese, worden beschouwd als typische doelwitten van herbiciden. Verbindingen die de functie van microtubuli remmen, vormen een veelvoorkomende klasse herbiciden die de plantengroei beïnvloeden door de mitoseregulatie te beïnvloeden.
Microtubuli zijn componenten van het cytoskelet en zijn wijdverspreid geconserveerd in eukaryotische cellen. Het tubuline-heterodimeer bestaat uit α-tubuline en β-tubuline en vormt lineaire microtubuli-protofilamenten, waarbij 13 protofilamenten een cilindrische structuur vormen. Microtubuli spelen meerdere rollen in plantencellen, waaronder het bepalen van de celvorm, celdeling en intracellulair transport3,4. Plantencellen bevatten microtubuli onder het interfaseplasmamembraan, en men denkt dat deze zogenaamde corticale microtubuli de organisatie van cellulosemicrofibrillen controleren door de regulatie van cellulosesynthasecomplexen4,5. Corticale microtubuli van wortel-epidermiscellen, aanwezig in de zone van snelle verlenging van de wortelpunt, bevinden zich lateraal, en cellulosemicrovezels volgen deze microtubuli en beperken de richting van celexpansie, waardoor anisotrope celverlenging wordt bevorderd. Daarom is de functie van microtubuli nauw verwant aan de morfologie van planten. Aminozuursubstituties in genen die coderen voor tubuline veroorzaken scheefgroei van corticale microtubuli-arrays en links- of rechtszijdige groei in Arabidopsis 6,7. Evenzo kunnen mutaties in microtubuli-geassocieerde eiwitten die de microtubuli-dynamiek reguleren, ook leiden tot verstoorde wortelgroei8,9,10,11,12,13. Bovendien veroorzaakt behandeling met microtubuli-verstorende herbiciden zoals disopyramide, ook bekend als pretilachloor, ook linkszijdige schuine wortelgroei14. Deze gegevens wijzen erop dat nauwkeurige regulatie van de microtubulifunctie cruciaal is voor het bepalen van de groeirichting van planten.
Er zijn verschillende soorten microtubuli-remmers ontdekt en deze geneesmiddelen hebben aanzienlijke bijdragen geleverd aan het cytoskeletonderzoek, evenals aan de landbouw en de geneeskunde. Met name oryzalin, dinitroanilineverbindingen, disopyramide, benzamide-gerelateerde verbindingen en hun analogen kunnen de functie van microtubuli remmen en daarmee de plantengroei. Daarom worden ze veel gebruikt als herbiciden. Omdat microtubuli echter een belangrijk onderdeel zijn van planten- en dierencellen, zijn de meeste microtubuli-remmers cytotoxisch voor beide celtypen. Ondanks hun erkende nut als herbiciden, wordt daarom slechts een beperkt aantal antimicrotubuli-middelen voor praktische doeleinden gebruikt.
Streptomyces is een geslacht uit de familie Streptomyces, dat aerobe, grampositieve, draadvormige bacteriën omvat en bekend staat om zijn vermogen om een breed scala aan secundaire metabolieten te produceren. Daarom wordt het beschouwd als een van de belangrijkste bronnen van nieuwe biologisch actieve natuurlijke producten. In de huidige studie ontdekten we een nieuwe verbinding genaamd coumamonamide, die werd geïsoleerd uit Streptomyces werraensis MK493-CF1 en S. werraensis ISP 5486. Met behulp van spectrale analyse en volledige spectrale analyse werd de structuur van coumamonamide gekarakteriseerd en werd het unieke N-alkoxypyrroolskelet bepaald. Synthese. Ursmonzuur, een synthetisch tussenproduct van ursmonoamide en zijn derivaten, bleek de groei en kieming van de populaire modelplant Arabidopsis thaliana te remmen. In een structuur-activiteitsrelatiestudie ontdekten we dat een verbinding met C9 gemodificeerd tot ursonzuur, genaamd nonyloxyderivaat van ursonzuur (KAND), het remmende effect op groei en kieming aanzienlijk versterkt. Opvallend is dat de nieuw ontdekte plantengroeiremmer ook de groei van tabak en levermos beïnvloedde en niet cytotoxisch was voor bacteriën of HeLa-cellen. Bovendien induceren sommige urmotonzuurderivaten een verstoord wortelfenotype, wat impliceert dat deze derivaten direct of indirect microtubuli beïnvloeden. In overeenstemming met dit idee wijzen onze observaties van microtubuli, immunohistochemisch of met fluorescerende eiwitten gelabeld, erop dat KAND-behandeling microtubuli depolymeriseert. Bovendien verstoorde behandeling met kumamotonzuurderivaten actinemicrofilamenten. Zo hebben we een nieuwe plantengroeiremmer ontdekt waarvan het unieke werkingsmechanisme bestaat uit vernietiging van het cytoskelet.
Stam MK493-CF1 werd geïsoleerd uit grond in Shinagawa-ku, Tokio. Stam MK493-CF1 vormde een goed vertakt stromamycelium. De gedeeltelijke sequentie van het 16S ribosomaal RNA-gen (1422 bp) werd bepaald. Deze stam lijkt sterk op S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: typische stam, 99,93%). Op basis van dit resultaat werd vastgesteld dat deze stam nauw verwant was aan de type stam van S. werraensis. Daarom hebben we deze stam voorlopig S. werraensis MK493-CF1 genoemd. S. werraensis ISP 5486T produceert ook dezelfde bioactieve stoffen. Omdat er in het begin weinig onderzoek was gedaan naar het verkrijgen van natuurlijke producten uit dit micro-organisme, werd er verder chemisch onderzoek uitgevoerd. Na 14 dagen kweken van S. werraensis MK493-CF1 op gerstmedium door middel van vaste-toestandfermentatie bij 30 °C, werd het medium geëxtraheerd met 50% EtOH. 60 ml monster werd gedroogd om 59,5 mg ruw extract te verkrijgen. Het ruwe extract werd onderworpen aan reverse-phase HPLC om N-methoxy-1H-pyrrool-2-carboxamide (1, genaamd coumamonamide, 36,0 mg) te verkrijgen. De totale hoeveelheid 1 is ongeveer 60% van het ruwe extract. Daarom besloten we de eigenschappen van kumamotoamide 1 in detail te bestuderen.
Coumamonamide 1 is een wit amorf poeder en hoge-resolutie massaspectrometrie (HRESIMS) bevestigt C6H8N2O2 (fig. 1). Het C2-gesubstitueerde pyrroolfragment van deze verbinding wordt gekenmerkt door δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH in 1H NMR-spectrum: 4,5 Hz, H-5) en δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), en het 13C NMR-spectrum toont de aanwezigheid van vier sp2-koolstofatomen. De aanwezigheid van een amidegroep op de C2-positie werd vastgesteld met behulp van HMBC-correlatie tussen het C-3-proton en het amidecarbonylkoolstofatoom bij δC 161,1. Bovendien duiden 1H- en 13C-NMR-pieken bij δH 4.10 (3H, S) en δC 68.3 op de aanwezigheid van N-methoxygroepen in het molecuul. Hoewel de juiste positie van de methoxygroep nog niet was bepaald met behulp van spectroscopische analyses zoals Enhanced Difference Spectroscopy en de nucleaire Overhauser-afkorting (NOEDF), werd N-methoxy-1H-pyrrool-2-carboxamide de eerste kandidaatverbinding.
Om de juiste structuur van 1 te bepalen, werd een totale synthese uitgevoerd (Fig. 2a). Behandeling van commercieel verkrijgbaar 2-aminopyridine 2 met m-CPBA resulteerde in het overeenkomstige N-oxide 3 in kwantitatieve opbrengst. Na de 2-aminoazidering van 2 werd de door Abramovich beschreven cyclocondensatiereactie uitgevoerd in benzeen bij 90 °C om het gewenste 1-hydroxy-1H-pyrrool-2-carbonitril 5 in grammen te verkrijgen. Snelheid 60% (twee stappen). 15,16. Methylering en hydrolyse van 4 leverde vervolgens 1-methoxy-1H-pyrrool-2-carbonzuur (genaamd "cumotonzuur", 6) op in een goede opbrengst (70%, twee stappen). Ten slotte leverde amidering via zuurchloride-intermediair 6 met behulp van waterige ammoniak Kumamoto-amide 1 op in een opbrengst van 98%. Alle spectrale gegevens van gesynthetiseerd 1 waren vergelijkbaar met die van geïsoleerd 1, dus werd de structuur van 1 bepaald;
Algemene synthese en analyse van de biologische activiteit van urbenamide en urbenzuur. (a) Totale synthese van Kumamoto-amide. (b) Zeven dagen oude wildtype Arabidopsis Columbia (Col)-zaailingen werden gekweekt op Murashige en Skoog (MS)-platen met coumamonamide 6 of coumamonamide 1 in de aangegeven concentraties. Schaalbalk = 1 cm.
Eerst hebben we de biologische activiteit van urbenamide en zijn intermediairen beoordeeld op hun vermogen om plantengroei te moduleren. We voegden verschillende concentraties ursmonamide 1 of ursmonzuur 6 toe aan MS-agarmedium en kweekten Arabidopsis thaliana-zaailingen op dit medium. Deze assays toonden aan dat hoge concentraties (500 μM) van 6 de wortelgroei remden (Fig. 2b). Vervolgens genereerden we verschillende derivaten door de N1-positie van 6 te vervangen en voerden we structuur-activiteitsrelatiestudies hierop uit (het analoge syntheseproces wordt beschreven in de ondersteunende informatie (SI)). Arabidopsis-zaailingen werden gekweekt op een medium met 50 μM ursonzuurderivaten en de wortellengte werd gemeten, zoals te zien is op de afbeelding. Zoals weergegeven in figuur 3a, b en S1, hebben coumamozuren verschillende lengtes lineaire alkoxyketens (9, 10, 11, 12 en 13) of grote alkoxyketens (15, 16 en 17) op de N1-positie. De derivaten vertoonden een significante remming van de wortelgroei. Daarnaast ontdekten we dat toediening van 200 μM 10, 11 of 17 de kieming remde (figuur 3c en S2).
Onderzoek naar de structuur-activiteitsrelatie van Kumamoto-amide en verwante verbindingen. (a) Structuur en syntheseschema van analogen. (b) Kwantificering van de wortellengte van 7 dagen oude zaailingen gekweekt op MS-medium met of zonder 50 μM coumamonamidederivaten. Asterisken geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (t-test, p< 0,05).18. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. nt betekent "niet getest" omdat meer dan 50% van de zaden niet ontkiemde. (c) Kwantificering van de kiemkracht van behandelde zaden, gedurende 7 dagen geïncubeerd in MS-medium met of zonder 200 μM coumamonamide en verwante verbindingen. Asterisken geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (chi-kwadraattoets). n=96.
Interessant genoeg verminderde de toevoeging van alkylzijketens langer dan C9 de remmende activiteit, wat suggereert dat verbindingen die verwant zijn aan kumamotoïnezuur zijketens van een bepaalde grootte nodig hebben om hun biologische activiteit te vertonen.
Omdat structuur-activiteitsrelatieanalyse aantoonde dat C9 was gemodificeerd tot ursonzuur en het nonyloxyderivaat van ursonzuur (hierna KAND 11 genoemd) de meest effectieve plantengroeiremmer was, hebben we een meer gedetailleerde karakterisering van KAND 11 uitgevoerd. Behandeling van Arabidopsis met 50 μM KAND 11 voorkwam de kieming vrijwel volledig, terwijl lagere concentraties (40, 30, 20 of 10 μM) KAND 11 de wortelgroei op een dosisafhankelijke manier remden (Fig. 4a, b). Om te testen of KAND 11 de levensvatbaarheid van het wortelmeristeem beïnvloedt, hebben we wortelmeristemen onderzocht die waren gekleurd met propidiumjodide (PI) en de grootte van het meristeemoppervlak gemeten. De grootte van het meristeem van zaailingen gekweekt op een medium met 25 μM KAND-11 was 151,1 ± 32,5 μm, terwijl de grootte van het meristeem van zaailingen gekweekt op een controlemedium met DMSO 264,7 ± 30,8 μm was (Fig. 4c, d), wat aangeeft dat KAND-11 de cellulaire activiteit herstelt. verspreiding. Wortelmeristeem. In overeenstemming hiermee verminderde behandeling met KAND 11 de hoeveelheid celdelingsmarker CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS-signaal in het wortelmeristeem (Fig. 4e) 17 . Deze resultaten geven aan dat KAND 11 de wortelgroei remt door de celproliferatieactiviteit te verminderen.
Analyse van het remmende effect van urbenonzuurderivaten (urbenyloxyderivaten) op de groei. (a) 7 dagen oude wildtype Col-zaailingen gekweekt op MS-platen met de aangegeven concentraties KAND 11. Schaalbalk = 1 cm. (b) Kwantificering van de wortellengte. Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p< 0,05).16. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. (c) Confocale microscopie van met propidiumjodide gekleurde wildtype Col-wortels, gekweekt op MS-platen met of zonder 25 μM KAND 11. Witte haakjes geven het wortelmeristeem aan. Schaalbalk = 100 µm. (d) Kwantificering van de wortelmeristeemgrootte (n = 10 tot 11). Statistische verschillen werden bepaald met behulp van de t-test (p< 0,05). De balken geven de gemiddelde meristeemgrootte weer. (e) Differentiële interferentiecontrast (DIC)-microscopie van een wortelmeristeem dat het CDKB2-construct bevat; 1pro: CDKB2; 1-GUS-kleuring en kleuring op 5 dagen oude zaailingen gekweekt op MS-platen met of zonder 25 µM KAND-test.
De fytotoxiciteit van KAND 11 werd verder getest met een andere tweezaadlobbige plant, tabak (Nicotiana tabacum), en een belangrijk modelorganisme, levermos (Marchantia polymorpha). Net als bij Arabidopsis produceerden tabaks-SR-1-zaailingen die gekweekt werden op medium met 25 μM KAND 11 kortere wortels (Fig. 5a). Bovendien ontkiemden 40 van de 48 zaden op platen met 200 μM KAND 11, terwijl alle 48 zaden ontkiemden op schijnbehandeld medium, wat aangeeft dat de hogere concentraties KAND significant waren (p< 0,05; chi-test -kwadraat) remde de kieming van tabak (Fig. 5b). Bovendien was de concentratie KAND 11 die de bacteriële groei in levermos remde vergelijkbaar met de effectieve concentratie in Arabidopsis (Fig. 5c). Deze resultaten geven aan dat KAND 11 de groei van diverse planten kan remmen. Vervolgens onderzochten we de mogelijke cytotoxiciteit van aan berenmonoamide verwante verbindingen in andere organismen, namelijk humane HeLa-cellen en Escherichia coli-stam DH5α, als representanten van respectievelijk hogere dierlijke en bacteriële cellen. In een reeks celproliferatietests observeerden we dat coumamonamide 1, coumamonamidezuur 6 en KAND 11 de groei van HeLa- of E. coli-cellen niet beïnvloedden bij concentraties van 100 μM (Fig. 5d,e).
Groeiremming van KAND 11 in niet-Arabidopsis organismen. (a) Twee weken oude wildtype SR-1 tabakszaailingen werden gekweekt op verticaal gepositioneerde MS-platen met 25 μM KAND 11. (b) Twee weken oude wildtype SR-1 tabakszaailingen werden gekweekt op horizontaal gepositioneerde MS-platen met 200 μM KAND 11. (c) Twee weken oude wildtype Tak-1 levermosknoppen gekweekt op Gamborg B5 platen met de aangegeven concentraties van KAND 11. Rode pijlen geven sporen aan die stopten met groeien binnen de incubatieperiode van twee weken. (d) Celproliferatietest van HeLa-cellen. Het aantal levensvatbare cellen werd gemeten op vaste tijdsintervallen met behulp van een celtelkit 8 (Dojindo). Als controle werden HeLa-cellen behandeld met 5 μg/ml actinomycine D (Act D), dat de RNA-polymerasetranscriptie remt en celdood veroorzaakt. Analyses werden in drievoud uitgevoerd. (e) E. coli-celproliferatietest. De groei van E. coli werd geanalyseerd door de OD600 te meten. Als controle werden de cellen behandeld met 50 μg/ml ampicilline (Amp), wat de synthese van de bacteriële celwand remt. Analyses werden in drievoud uitgevoerd.
Om het werkingsmechanisme van de cytotoxiciteit veroorzaakt door uramide-gerelateerde verbindingen te ontcijferen, hebben we urbeenzuurderivaten met matige remmende effecten opnieuw geanalyseerd, zoals te zien is op de afbeelding. Zoals te zien is in de figuren 2b en 6a, produceerden zaailingen gekweekt op agarplaten met hoge concentraties (200 μM) urmotonzuur 6 kortere en naar links gebogen wortels (θ = – 23,7 ± 6,1), terwijl zaailingen gekweekt op het controlemedium vrijwel rechte wortels produceerden (θ = – 3,8 ± 7,1). Het is bekend dat deze karakteristieke schuine groei het gevolg is van een disfunctie van corticale microtubuli14,18. In overeenstemming met deze bevinding induceerden de microtubuli-destabiliserende geneesmiddelen disopyramide en oryzalin een vergelijkbare wortelkanteling onder onze groeiomstandigheden (figuren 2b en 6a). Tegelijkertijd testten we urmotonzuurderivaten en selecteerden we er verschillende die, in bepaalde concentraties, schuine wortelgroei induceerden. Verbindingen 8, 9 en 15 veranderden de richting van de wortelgroei bij respectievelijk 75 μM, 50 μM en 40 μM, wat aangeeft dat deze verbindingen microtubuli effectief kunnen destabiliseren (Fig. 2b, 6a). We testten ook het krachtigste ursolzuurderivaat, KAND 11, in een lagere concentratie (15 µM) en ontdekten dat toediening van KAND 11 de wortelgroei remde en dat de wortelgroeirichting ongelijkmatig was, hoewel de neiging had om naar links te hellen (Figuur C3). Omdat hogere concentraties van microtubuli-destabiliserende medicijnen soms de plantengroei remmen in plaats van wortelkanteling te veroorzaken, onderzochten we vervolgens de mogelijkheid dat KAND 11 microtubuli beïnvloedt door corticale microtubuli in wortel-epidermiscellen te observeren. Immunohistochemie met anti-β-tubuline-antilichamen in epidermale cellen van zaailingwortels behandeld met 25 μM KAND 11 toonde aan dat bijna alle corticale microtubuli in epidermale cellen in de elongatiezone verdwenen (fig. 6b). Deze resultaten geven aan dat kumamotonzuur en zijn derivaten direct of indirect inwerken op microtubuli en deze verstoren, en dat deze verbindingen nieuwe microtubuli-remmers zijn.
Ursonzuur en derivaten daarvan beïnvloeden corticale microtubuli in Arabidopsis thaliana. (a) Wortelhellingshoek gemeten in aanwezigheid van verschillende urmotonzuurderivaten in de aangegeven concentraties. De effecten van twee stoffen waarvan bekend is dat ze microtubuli remmen: disopyramide en oryzalin, werden ook geanalyseerd. De inzet toont de standaard die gebruikt wordt om de wortelgroeihoek te meten. Asterisken geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (t-test, p< 0,05).19. Schaalbalk = 1 cm. (b) Corticale microtubuli in epidermale cellen in de elongatiezone. Microtubuli in wildtype Arabidopsis Col-wortels gekweekt op MS-platen met of zonder 25 μM KAND 11 werden gevisualiseerd door immunohistochemische kleuring met behulp van primaire β-tubuline-antilichamen en Alexa Fluor-geconjugeerde secundaire antilichamen. Schaalbalk = 10 µm. (c) Mitotische structuur van microtubuli in het wortelmeristeem. Microtubuli werden gevisualiseerd met behulp van immunohistochemische kleuring. Mitotische structuren, waaronder profasezones, spoellichamen en fragmoplasten, werden geteld op basis van confocale beelden. Pijlen geven mitotische microtubulistructuren aan. Asterisken geven significante verschillen aan met schijnbehandeling (t-test, p< 0,05).9. Schaalbalk = 50 µm.
Hoewel Ursa de functie van microtubuli kan verstoren, wordt verwacht dat het werkingsmechanisme verschilt van dat van typische depolymeriserende middelen voor microtubuli. Zo induceren hogere concentraties van depolymeriserende middelen voor microtubuli, zoals disopyramide en oryzalin, anisotrope expansie van epidermale cellen, terwijl KAND 11 dat niet doet. Bovendien resulteerde gelijktijdige toediening van KAND 11 en disopyramide in een gecombineerde disopyramide-geïnduceerde wortelgroeirespons en werd KAND 11-geïnduceerde groeiremming waargenomen (Fig. S4). We analyseerden ook de respons van de overgevoelige disopyramide 1-1 (phs1-1) mutant op KAND 11. phs1-1 heeft een niet-canonieke tubulinekinasepuntmutatie en produceert kortere wortels bij behandeling met disopyramide9,20. phs1-1 mutante zaailingen gekweekt op agarmedium met KAND 11 hadden kortere wortels, vergelijkbaar met die gekweekt op disopyramide (fig. S5).
Bovendien observeerden we mitotische microtubulistructuren, zoals profasezones, spoellichamen en fragmoplasten, in het wortelmeristeem van zaailingen die behandeld waren met KAND 11. In overeenstemming met de observaties voor CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS werd een significante afname van het aantal mitotische microtubuli waargenomen (Fig. 6c).
Om de cytotoxiciteit van KAND 11 op subcellulair niveau te karakteriseren, behandelden we tabaks-BY-2-suspensiecellen met KAND 11 en observeerden we hun respons. We voegden eerst KAND 11 toe aan BY-2-cellen die TagRFP-TUA6 tot expressie brachten, een fluorescerend label voor microtubuli, om het effect van KAND 11 op corticale microtubuli te beoordelen. De dichtheid van corticale microtubuli werd bepaald met behulp van beeldanalyse, waarmee het percentage cytoskeletpixels ten opzichte van cytoplasmatische pixels werd gekwantificeerd. De testresultaten toonden aan dat na behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 gedurende 1 uur de dichtheid significant afnam tot respectievelijk 0,94 ± 0,74% of 0,23 ± 0,28%, terwijl de dichtheid van cellen behandeld met DMSO 1,61 ± 0,34% bedroeg (Fig. 7a). Deze resultaten komen overeen met de observatie in Arabidopsis dat behandeling met KAND 11 depolymerisatie van corticale microtubuli induceert (Fig. 6b). We onderzochten ook de BY-2-lijn met GFP-ABD-gelabelde actinefilamenten na behandeling met dezelfde concentratie KAND 11 en zagen dat behandeling met KAND 11 de actinefilamenten verstoorde. Behandeling met 50 μM of 100 μM KAND 11 gedurende 1 uur verlaagde de actinefilamentdichtheid significant tot respectievelijk 1,20 ± 0,62% of 0,61 ± 0,26%, terwijl de dichtheid in met DMSO behandelde cellen 1,69 ± 0,51% bedroeg (Fig. 2). (Fig. 7b). Deze resultaten contrasteren met de effecten van propyzamide, dat actinefilamenten niet beïnvloedt, en latrunculine B, een actinedepolymerisator die microtubuli niet beïnvloedt (SI Figuur S6). Bovendien had behandeling met coumamonamide 1, coumamonamidezuur 6 of KAND 11 geen effect op de microtubuli in HeLa-cellen (SI Figuur S7). Het werkingsmechanisme van KAND 11 verschilt daarom vermoedelijk van dat van bekende cytoskeletverstoorders. Onze microscopische observatie van BY-2-cellen behandeld met KAND 11 onthulde bovendien het begin van celdood tijdens de KAND 11-behandeling en toonde aan dat het percentage Evans-blauw gekleurde dode cellen niet significant toenam na 30 minuten behandeling met KAND 11, terwijl het aantal dode cellen na 90 minuten behandeling met 50 μM of 100 μM KAND toenam tot respectievelijk 43,7% en 80,1% (Figuur 7c). Samengevat duiden deze gegevens erop dat het nieuwe ursolinezuurderivaat KAND 11 een plantspecifieke cytoskeletremmer is met een tot nu toe onbekend werkingsmechanisme.
KAND beïnvloedt corticale microtubuli, actinefilamenten en de levensvatbaarheid van tabaks-BY-2-cellen. (a) Visualisatie van corticale microtubuli in BY-2-cellen in aanwezigheid van TagRFP-TUA6. BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met behulp van confocale microscopie. De dichtheid van corticale microtubuli werd berekend op basis van microfoto's van 25 onafhankelijke cellen. Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p< 0,05). Schaalbalk = 10 µm. (b) Corticale actinefilamenten in BY-2-cellen gevisualiseerd in aanwezigheid van GFP-ABD2. BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met behulp van confocale microscopie. De dichtheid van corticale actinefilamenten werd berekend op basis van microfoto's van 25 onafhankelijke cellen. Letters geven significante verschillen aan (Tukey HSD-test, p< 0,05). Schaalbalk = 10 µm. (c) Observatie van dode BY-2-cellen door middel van Evans-blauwkleuring. BY-2-cellen behandeld met KAND 11 (50 μM of 100 μM) of DMSO werden onderzocht met behulp van helderveldmicroscopie. n=3. Schaalbalk = 100 µm.
De ontdekking en toepassing van nieuwe natuurlijke producten heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in diverse aspecten van het menselijk leven, waaronder geneeskunde en landbouw. Historisch onderzoek is uitgevoerd om nuttige stoffen uit natuurlijke bronnen te verkrijgen. Actinomyceten staan met name bekend als nuttig antiparasitaire antibiotica voor nematoden vanwege hun vermogen om diverse secundaire metabolieten te produceren, zoals avermectine, de belangrijkste verbinding van ivermectine en bleomycine en derivaten daarvan, die medicinaal worden gebruikt als antikankermiddel21,22. Evenzo zijn er diverse herbiciden ontdekt in actinomyceten, waarvan sommige al commercieel worden gebruikt1,23. Daarom wordt de analyse van actinomycetenmetabolieten om natuurlijke producten met de gewenste biologische activiteit te isoleren als een effectieve strategie beschouwd. In deze studie hebben we een nieuwe verbinding ontdekt, coumamonamide, van S. werraensis, en deze met succes gesynthetiseerd. Ursoonzuur is een synthetisch tussenproduct van urbenamide en derivaten daarvan. Het kan karakteristieke wortelkrulvorming veroorzaken, een matige tot sterke herbicide werking hebben en direct of indirect de microtubuli van planten beschadigen. Het werkingsmechanisme van urmotonzuur kan echter verschillen van dat van bestaande microtubuli-remmers, aangezien KAND 11 ook actinefilamenten verstoort en celdood veroorzaakt. Dit suggereert een regulerend mechanisme waarmee urmotonzuur en zijn derivaten een breed scala aan cytoskeletstructuren beïnvloeden.
Verdere gedetailleerde karakterisering van urbenonzuur zal helpen om het werkingsmechanisme van urbenonzuur beter te begrijpen. Het volgende doel is met name om het vermogen van ursonzuur om te binden aan gereduceerde microtubuli te evalueren om te bepalen of ursonzuur en zijn derivaten direct inwerken op microtubuli en deze depolymeriseren, of dat hun werking leidt tot destabilisatie van microtubuli. Bovendien, in het geval dat microtubuli geen direct doelwit zijn, zal het identificeren van de werkingsplaats en moleculaire doelwitten van ursonzuur op plantencellen helpen om de eigenschappen van verwante verbindingen en mogelijke manieren om de herbicide activiteit te verbeteren, beter te begrijpen. Onze bioactiviteitstest onthulde het unieke cytotoxische vermogen van ursonzuur op de groei van planten zoals Arabidopsis thaliana, tabak en levermos, terwijl noch E. coli noch HeLa-cellen werden beïnvloed. Weinig of geen toxiciteit voor dierlijke cellen is een voordeel van ursonzuurderivaten wanneer ze worden ontwikkeld als herbiciden voor gebruik in open landbouwvelden. Omdat microtubuli veelvoorkomende structuren zijn in eukaryoten, is hun selectieve remming in planten een essentiële voorwaarde voor herbiciden. Zo wordt propyzamide, een depolymeriserend middel voor microtubuli dat direct aan tubuline bindt en polymerisatie remt, gebruikt als herbicide vanwege de lage toxiciteit voor dierlijke cellen24. In tegenstelling tot disopyramide hebben verwante benzamiden verschillende doelwitspecificiteiten. Naast plantenmicrotubuli remmen RH-4032 en benzoxamide ook microtubuli van respectievelijk dierlijke cellen of oömyceten, en wordt zalilamide gebruikt als fungicide vanwege de lage fytotoxiciteit25,26,27. De nieuw ontdekte beer en zijn derivaten vertonen selectieve cytotoxiciteit tegen planten, maar het is belangrijk om op te merken dat verdere modificaties hun doelwitspecificiteit kunnen veranderen, wat mogelijk extra derivaten oplevert voor de bestrijding van pathogene schimmels of oömyceten.
De unieke eigenschappen van urbenonzuur en zijn derivaten zijn nuttig voor hun ontwikkeling als herbiciden en gebruik als onderzoeksinstrument. Het belang van het cytoskelet bij het reguleren van de vorm van plantencellen wordt algemeen erkend. Eerdere studies hebben aangetoond dat planten complexe mechanismen van corticale microtubuli-organisatie hebben ontwikkeld door de dynamiek van microtubuli te reguleren om de morfogenese correct te beheersen. Een groot aantal moleculen die verantwoordelijk zijn voor de regulatie van microtubuli-activiteit is geïdentificeerd en gerelateerd onderzoek is nog gaande3,4,28. Ons huidige begrip van de dynamiek van microtubuli in plantencellen verklaart de mechanismen van corticale microtubuli-organisatie niet volledig. Hoewel bijvoorbeeld zowel disopyramide als oryzalin microtubuli kunnen depolymeriseren, veroorzaakt disopyramide ernstige wortelvervorming, terwijl oryzalin een relatief mild effect heeft. Bovendien veroorzaken mutaties in tubuline, dat microtubuli stabiliseert, ook rechtsdraaiende wortels, terwijl paclitaxel, dat ook de dynamiek van microtubuli stabiliseert, dat niet doet. Het bestuderen en identificeren van de moleculaire doelwitten van ursolinezuur zou daarom nieuwe inzichten moeten opleveren in de regulatie van corticale microtubuli in planten. Ook toekomstige vergelijkingen van chemicaliën die effectief zijn in het bevorderen van verstoorde groei, zoals disopyramide, en minder effectieve chemicaliën, zoals oryzalin of kumamotorzuur, zullen aanwijzingen geven over hoe verstoorde groei ontstaat.
Aan de andere kant vormen afweergerelateerde cytoskeletherschikkingen een andere mogelijkheid om de cytotoxiciteit van ursonzuur te verklaren. Infectie met een pathogeen of introductie van een elicitor in plantencellen veroorzaakt soms vernietiging van het cytoskelet en daaropvolgende celdood29. Zo is bijvoorbeeld gerapporteerd dat cryptoxanthine, afkomstig van oömyceten, microtubuli en actinefilamenten verstoort vóór de celdood van tabakscellen, vergelijkbaar met wat er gebeurt bij KAND-behandeling30,31. De overeenkomsten tussen afweerreacties en cellulaire reacties geïnduceerd door ursonzuur brachten ons tot de hypothese dat ze gemeenschappelijke cellulaire processen in gang zetten, hoewel een sneller en sterker effect van ursonzuur dan cryptoxanthine evident is. Studies hebben echter aangetoond dat verstoring van actinefilamenten spontane celdood bevordert, wat niet altijd gepaard gaat met verstoring van microtubuli29. Bovendien is het nog maar de vraag of de pathogeen of de elicitor verstoorde wortelgroei veroorzaakt, zoals ursonzuurderivaten doen. Moleculaire kennis die de link legt tussen afweerreacties en het cytoskelet is daarom een aantrekkelijk probleem om aan te pakken. Door gebruik te maken van de aanwezigheid van laagmoleculaire verbindingen die verwant zijn aan ursonzuur, evenals een reeks derivaten met verschillende potenties, kunnen ze mogelijkheden bieden om onbekende cellulaire mechanismen aan te pakken.
Samengevat, de ontdekking en toepassing van nieuwe verbindingen die de dynamiek van microtubuli moduleren, zullen krachtige methoden bieden om de complexe moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de vormbepaling van plantencellen te onderzoeken. In deze context kan de recent ontwikkelde verbinding urmotonzuur, die microtubuli en actinefilamenten beïnvloedt en celdood induceert, een mogelijkheid bieden om het verband tussen microtubulicontrole en deze andere mechanismen te ontrafelen. Chemische en biologische analyse met urbenonzuur zal ons dus helpen de moleculaire regulatiemechanismen te begrijpen die het cytoskelet van planten controleren.
Inoculeer S. werraensis MK493-CF1 in een 500 ml erlenmeyer met een schotje en 110 ml entmedium bestaande uit 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) essence pasta, 1% (w/v) Bacto composition. -soja (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) maïsextract (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0,2% (w/v) (NH₂)₄SO₄ en 0,2% CaCO₂ in gedeïoniseerd water (pH 7,4 vóór sterilisatie). De zaadculturen werden gedurende 2 dagen geïncubeerd op een roterende schudmachine (180 tpm) bij 27 °C. Productiekweek via vaste-toestandfermentatie. De zaadcultuur (7 ml) werd overgebracht naar een K-1-kolf van 500 ml met 40 g productiemedium, bestaande uit 15 g geperste gerst (MUSO Co., Ltd., Japan) en 25 g gedeïoniseerd water (pH niet aangepast vóór sterilisatie). De fermentatie werd gedurende 14 dagen uitgevoerd bij 30 °C in het donker. Het fermentatiemateriaal werd geëxtraheerd met 40 ml/fles EtOH en gecentrifugeerd (1500 g, 4 °C, 10 min). De kweeksupernatant (60 ml) werd geëxtraheerd met een mengsel van 10% MeOH/EtOAc. De organische laag werd onder verminderde druk verdampt om een residu (59,5 mg) te verkrijgen, dat werd onderworpen aan HPLC met gradiëntelutie (0–10 minuten: 90%) op een omgekeerde fasekolom (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × lengte 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 minuten: 90% H2O/CH3CN tot 70% H2O/CH3CN (gradiënt), 35–45 minuten: 90% H2O/EtOH, 45–155 minuten: 90% H2O/EtOH tot 100% EtOH (gradiënt (gradiënt), 155–200 min: 100% EtOH) bij een stroomsnelheid van 1,5 ml/min, coumamonamide (1, 36,0 mg) werd geïsoleerd als een wit amorf poeder.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ berekende waarde: 141,0659, gemeten waarde: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Columbia-zaden (Col-0) werden verkregen van het Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) met toestemming voor onderzoeksdoeleinden. De Col-0-zaden werden vermeerderd en onderhouden onder onze laboratoriumomstandigheden en gebruikt als wilde Arabidopsis-planten. Arabidopsis-zaden werden oppervlaktegesteriliseerd en gekweekt in halfsterk Murashige- en Skoog-medium met 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)ethaansulfonzuur (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) en 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, bij 23 °C en constant licht. Zaden van de phs1-1-mutant werden geleverd door T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Zaden van stam SR-1 werden geleverd door T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) en gebruikt als wilde tabaksplanten. De tabakszaden werden aan de oppervlakte gesteriliseerd en drie nachten in steriel water geweekt om de kieming te bevorderen. Vervolgens werden ze in een oplossing van halve sterkte geplaatst met 2% sucrose, 0,05% (w/v) MES en 0,8% gellangom (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. (en Skoog-medium) met pH 5,7 en geïncubeerd bij 23 °C onder constant licht.
Stam Tak-1 werd geleverd door T. Kohchi (Universiteit van Kyoto) en werd gebruikt als standaard experimentele eenheid voor de levermosstudie. Gemma werd verkregen uit gesteriliseerde gekweekte planten en vervolgens uitgeplaat op Gamborg B5-medium (Fujifilm Wako Pure Chemical) met 1% sucrose en 0,3% gellangom, en geïncubeerd bij 23 °C onder continu licht.
Tabak BY-2-cellen (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) werden geleverd door S. Hasezawa (Universiteit van Tokio). BY-2-cellen werden 95-voudig verdund in gemodificeerd Linsmeier- en Skoog-medium en wekelijks aangevuld met 2,4-dichloorfenoxyazijnzuur 32 . De celsuspensie werd gemengd op een roterende schudmachine bij 130 rpm bij 27 °C in het donker. Was de cellen met 10 keer het volume vers medium en resuspendeer in hetzelfde medium. Transgene BY-2-cellijnen die stabiel de microtubuli-marker TagRFP-TUA6 of de actinefilamentmarker GFP-ABD2 tot expressie brachten onder de 35S-promotor van het bloemkoolmozaïekvirus werden gegenereerd zoals beschreven33,34,35. Deze cellijnen kunnen worden onderhouden en gesynchroniseerd met behulp van procedures die vergelijkbaar zijn met die gebruikt voor de oorspronkelijke BY-2-cellijn.
HeLa-cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies), aangevuld met 10% foetaal runder serum, 1,2 U/ml penicilline en 1,2 μg/ml streptomycine in een broedstoof van 37°C met 5% CO2.
Alle experimenten die in dit manuscript worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Japanse regelgeving en richtlijnen op het gebied van biologische veiligheid.
Verbindingen werden opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) als stamoplossingen en verdund in MS-medium voor Arabidopsis en tabak of Gamborg B5-medium voor levermos. Voor de wortelgroeiremmingstest werden meer dan 10 zaden per plaat gezaaid op agarmedium met de aangegeven verbindingen of DMSO. De zaden werden 7 dagen in een groeikamer geïncubeerd. De zaailingen werden gefotografeerd en de lengte van de wortels werd gemeten. Voor de kiemingstest van Arabidopsis werden 48 zaden per plaat gezaaid op agarmedium met 200 μM verbinding of DMSO. Arabidopsis-zaden werden gekweekt in een groeikamer en het aantal gekiemde zaailingen werd 7 dagen na kieming (dag) geteld. Voor de tabakkiemingstest werden 24 zaden per plaat gezaaid op agarmedium met 200 μM KAND of DMSO. Tabakszaden werden gekweekt in een groeikamer en het aantal ontkiemde zaailingen werd na 14 dagen geteld. Voor de levermos-groeiremmingstest werden 9 embryo's van elke plaat uitgeplaat op agarmedium met de aangegeven concentraties KAND of DMSO en gedurende 14 dagen in een groeikamer geïncubeerd.
Gebruik zaailingen gekleurd met 5 mg/ml propidiumjodide (PI) om de organisatie van het wortelmeristeem te visualiseren. PI-signalen werden waargenomen met behulp van fluorescentiemicroscopie met een TCS SPE confocale laserscanmicroscoop (Leica Microsystems).
Histochemische kleuring van wortels met β-glucuronidase (GUS) werd uitgevoerd volgens het protocol beschreven door Malami en Benfey36. Zaailingen werden een nacht gefixeerd in 90% aceton, gedurende 1 uur gekleurd met 0,5 mg/ml 5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-d-glucuronzuur in GUS-buffer en vervolgens in een gehydrateerde chlooraldehyde-oplossing geplaatst (8 g chlooraalhydraat, 2 ml water en 1 ml glycerol) en bekeken met behulp van differentiële interferentiecontrastmicroscopie met een Axio Imager M1-microscoop (Carl Zeiss).
De wortelhoeken werden gemeten bij 7 dagen oude zaailingen die op verticaal geplaatste platen waren gekweekt. Meet de hoek van de wortel ten opzichte van de richting van de zwaartekrachtvector zoals beschreven in stap 6.
De rangschikking van corticale microtubuli werd waargenomen zoals beschreven, met kleine aanpassingen aan het protocol 37 . Anti-β-tubuline-antilichaam (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) en Alexa Fluor 488-geconjugeerd anti-muis-IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) werden gebruikt als primaire en secundaire antilichamen in respectievelijk verdunningen van 1:1000 en 1:100. Fluorescentiebeelden werden verkregen met een TCS SPE confocale laserscanmicroscoop (Leica Microsystems). Verkrijg Z-stackbeelden en creëer projecties met maximale intensiteit volgens de instructies van de fabrikant.
De HeLa-celproliferatietest werd uitgevoerd met behulp van Cell Counting Kit 8 (Dojindo) volgens de instructies van de fabrikant.
De groei van E. coli DH5α werd geanalyseerd door de celdichtheid in cultuur te meten met een spectrofotometer bij 600 nm (OD600).
De cytoskeletorganisatie in transgene BY-2-cellen werd waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop uitgerust met een CSU-X1 confocale scanning-inrichting (Yokogawa) en een sCMOS-camera (Zyla, Andor Technology). De cytoskeletdichtheid werd beoordeeld door middel van beeldanalyse, waarbij het percentage cytoskeletpixels ten opzichte van cytoplasmatische pixels in confocale beelden werd gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software, zoals beschreven38,39.
Om celdood in BY-2-cellen te detecteren, werd een aliquot van de celsuspensie gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd met 0,05% Evans-blauw. Selectieve Evans-blauwkleuring van dode cellen is afhankelijk van de extrusie van de kleurstof uit levensvatbare cellen door het intacte plasmamembraan40. Gekleurde cellen werden bekeken met een helderveldmicroscoop (BX53, Olympus).
HeLa-cellen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2. De cellen werden 6 uur bij 37 °C behandeld met 100 μM KAND 11, kumamonaminezuur 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemide (Gibco) of 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma). De cellen werden 10 minuten gefixeerd met MetOH en vervolgens 5 minuten met acetaat bij kamertemperatuur. De gefixeerde cellen werden 2 uur geïncubeerd met β-tubuline primair antilichaam (1D4A4, Proteintech: 66240-1) verdund in 0,5% BSA/PBS, 3 keer gewassen met TBST en vervolgens geïncubeerd met Alexa Fluor geitenantilichaam. 488 1 uur. – Muis-IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) en 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) verdund in 0,5% BSA/PBS. Na driemaal wassen met TBST werden de gekleurde cellen bekeken onder een Nikon Eclipse Ti-E omkeermicroscoop. De beelden werden vastgelegd met een gekoelde Hamamatsu ORCA-R2 CCD-camera met behulp van MetaMorph-software (Molecular Devices).
Plaatsingstijd: 17 juni 2024