De dennenaaltjes zijn een migrerende endoparasiet die onder quarantaine staat en bekend staat om de ernstige economische verliezen die ze veroorzaken in dennenbosecosystemen. Deze studie onderzoekt de nematicide werking van gehalogeneerde indolen tegen dennenaaltjes en hun werkingsmechanisme. De nematicide werking van 5-joodindool en avermectine (positieve controle) tegen dennenaaltjes was vergelijkbaar en hoog bij lage concentraties (10 μg/mL). 5-joodindool verminderde de vruchtbaarheid, de reproductieve activiteit, de embryonale en larvale sterfte en het locomotorische gedrag. Moleculaire interacties van liganden met ongewervelde-specifieke glutamaat-gated chloridekanaalreceptoren ondersteunen het idee dat 5-joodindool, net als avermectine, zich sterk bindt aan de actieve plaats van de receptor. 5-joodindool induceerde ook verschillende fenotypische afwijkingen bij de aaltjes, waaronder abnormale orgaanverkleining/krimp en toegenomen vacuolisatie. Deze resultaten suggereren dat vacuolen een rol kunnen spelen bij de door methylering veroorzaakte dood van nematoden. Belangrijk is dat 5-jodoindool niet giftig was voor beide plantensoorten (kool en radijs). Deze studie toont dus aan dat toepassing van jodoindool onder omgevingsomstandigheden de schade door dennenverwelking kan bestrijden.
De dennenhoutnematode (Bursaphelenchus xylophilus) behoort tot de dennenhoutnematoden (PWN), migrerende endoparasitaire nematoden die bekend staan om de ernstige ecologische schade die ze aanrichten aan ecosystemen van dennenbossen¹. De dennenverwelkingsziekte (PWD), veroorzaakt door de dennenhoutnematode, wordt een ernstig probleem op verschillende continenten, waaronder Azië en Europa, en in Noord-Amerika vernietigt de nematode geïntroduceerde dennensoorten¹,². De achteruitgang van dennenbomen is een groot economisch probleem en de vooruitzichten voor de wereldwijde verspreiding ervan zijn zorgwekkend³. De volgende dennensoorten worden het meest aangevallen door de nematode: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii en Pinus radiata⁴. De dennenhoutnematode is een ernstige ziekte die dennenbomen binnen enkele weken of maanden na infectie kan doden. Daarnaast komen uitbraken van dennenaaltjes vaak voor in diverse ecosystemen, waardoor er hardnekkige infectieketens zijn ontstaan1.
Bursaphelenchus xylophilus is een quarantaine-plantparasitaire nematode die behoort tot de superfamilie Aphelenchoidea en clade 102.5. De nematode voedt zich met schimmels en plant zich voort in het houtweefsel van dennenbomen, waarbij hij vier verschillende larvenstadia doorloopt: L1, L2, L3, L4 en een volwassen individu1,6. Onder omstandigheden van voedseltekort ondergaat de dennennematode een gespecialiseerd larvenstadium – de dauerlarve – waarin hij zijn vector, de dennenbastkever (Monochamus alternatus), parasiteert en wordt overgebracht naar gezonde dennenbomen. In gezonde gastheren migreren de nematoden snel door het plantenweefsel en voeden zich met parenchymcellen, wat leidt tot een aantal overgevoeligheidsreacties, verwelking van de dennenboom en de dood binnen een jaar na infectie1,7,8.
De biologische bestrijding van dennenaaltjes is al lange tijd een uitdaging, met quarantainemaatregelen die teruggaan tot de 20e eeuw. De huidige strategieën voor de bestrijding van dennenaaltjes omvatten voornamelijk chemische behandelingen, waaronder houtfumigatie en het inbrengen van nematiciden in boomstammen. De meest gebruikte nematiciden zijn avermectine en avermectinebenzoaat, die tot de avermectinefamilie behoren. Deze dure chemicaliën zijn zeer effectief tegen veel aaltjessoorten en worden als milieuvriendelijk beschouwd⁹. Herhaald gebruik van deze nematiciden zal echter naar verwachting selectiedruk creëren die vrijwel zeker zal leiden tot het ontstaan van resistente dennenaaltjes, zoals is aangetoond bij verschillende insectenplagen, zoals Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella en de aaltjes Trichostrongylus colubriformis en Ostertagia circumcincta, die geleidelijk resistentie tegen avermectinen hebben ontwikkeld¹⁰,¹¹,¹². Daarom moeten resistentiepatronen regelmatig worden bestudeerd en moeten nematiciden continu worden gescreend om alternatieve, kosteneffectieve en milieuvriendelijke maatregelen te vinden voor de bestrijding van PVD. In de afgelopen decennia hebben verschillende auteurs het gebruik van plantenextracten, etherische oliën en vluchtige stoffen voorgesteld als middelen voor de bestrijding van nematoden13,14,15,16.
We hebben onlangs de nematicide activiteit van indool, een intercellulair en interkingdom signaalmolecuul, aangetoond in Caenorhabditis elegans 17. Indool is een wijdverspreid intracellulair signaal in de microbiële ecologie en reguleert talrijke functies die van invloed zijn op de microbiële fysiologie, sporevorming, plasmidestabiliteit, resistentie tegen geneesmiddelen, biofilmvorming en virulentie 18, 19. De activiteit van indool en zijn derivaten tegen andere pathogene nematoden is nog niet onderzocht. In deze studie onderzochten we de nematicide activiteit van 34 indolen tegen dennennematoden en brachten we het werkingsmechanisme van het meest potente 5-joodindool in kaart met behulp van microscopie, time-lapse fotografie en moleculaire dockingexperimenten. Daarnaast beoordeelden we de toxische effecten ervan op planten met behulp van een zaadkiemingstest.
Er is eerder gerapporteerd dat hoge concentraties (>1,0 mM) indool een nematicide werking hebben op nematoden17. Na behandeling van B. xylophilus (gemengde levensstadia) met indool of 33 verschillende indoolderivaten bij 1 mM werd de mortaliteit van B. xylophilus gemeten door het tellen van levende en dode nematoden in de controle- en behandelde groepen. Vijf indolen vertoonden significante nematicide activiteit; de overleving van de onbehandelde controlegroep was 95 ± 7% na 24 uur. Van de 34 geteste indolen veroorzaakten 5-joodindool en 4-fluorindool bij 1 mM 100% mortaliteit, terwijl 5,6-difluorindigo, methylindool-7-carboxylaat en 7-joodindool ongeveer 50% mortaliteit veroorzaakten (Tabel 1).
Effect van 5-joodindool op vacuolevorming en metabolisme van de dennenhoutaaltjes. (A) Effect van avermectine en 5-joodindool op volwassen mannelijke aaltjes, (B) eitjes in het L1-stadium en (C) metabolisme van B. xylophilus, (i) er werden geen vacuolen waargenomen na 0 uur, behandeling resulteerde in (ii) vacuolen, (iii) accumulatie van meerdere vacuolen, (iv) zwelling van vacuolen, (v) fusie van vacuolen en (vi) vorming van reuzenvacuolen. Rode pijlen geven zwelling van vacuolen aan, blauwe pijlen fusie van vacuolen en zwarte pijlen reuzenvacuolen. Schaalbalk = 50 μm.
Daarnaast beschreef deze studie ook het sequentiële proces van methaan-geïnduceerde sterfte bij dennenaaltjes (Figuur 4C). Methanogene sterfte is een niet-apoptotische vorm van celdood die gepaard gaat met de accumulatie van prominente cytoplasmatische vacuolen27. De morfologische defecten die bij dennenaaltjes werden waargenomen, lijken nauw verband te houden met het mechanisme van methaan-geïnduceerde sterfte. Microscopisch onderzoek op verschillende tijdstippen toonde aan dat er na 20 uur blootstelling aan 5-joodindool (0,1 mM) gigantische vacuolen werden gevormd. Microscopische vacuolen werden waargenomen na 8 uur behandeling en hun aantal nam toe na 12 uur. Na 14 uur werden verschillende grote vacuolen waargenomen. Na 12-16 uur behandeling waren verschillende gefuseerde vacuolen duidelijk zichtbaar, wat aangeeft dat vacuolefusie de basis vormt van het methanogene sterftemechanisme. Na 20 uur werden er verschillende gigantische vacuolen in de worm aangetroffen. Deze waarnemingen vormen het eerste rapport over metuosis bij C. elegans.
Bij wormen die met 5-jodoindool waren behandeld, werden ook aggregatie en ruptuur van vacuolen waargenomen (Fig. 5), zoals blijkt uit het buigen van de wormen en het vrijkomen van vacuolen in de omgeving. Ook werd verstoring van de vacuolen waargenomen in het eierschaalmembraan, dat normaal gesproken intact blijft bij L2 tijdens het uitkomen (Aanvullende Fig. S2). Deze waarnemingen ondersteunen de betrokkenheid van vochtophoping en osmoregulatorische stoornissen, evenals omkeerbare celbeschadiging (RCI), bij het proces van vacuolevorming en ettervorming (Fig. 5).
Uitgaande van de hypothese dat jodium een rol speelt bij de waargenomen vacuolevorming, onderzochten we de nematicide activiteit van natriumjodide (NaI) en kaliumjodide (KI). Bij concentraties van 0,1, 0,5 of 1 mM hadden ze echter geen effect op de overleving van de nematoden of de vacuolevorming (aanvullende figuur S5), hoewel 1 mM KI een licht nematicide effect had. Aan de andere kant induceerde 7-joodindool (1 of 2 mM), net als 5-joodindool, meerdere vacuolen en structurele vervormingen (aanvullende figuur S6). De twee joodindolen vertoonden vergelijkbare fenotypische kenmerken in dennen-nematoden, terwijl NaI en KI dat niet deden. Opvallend is dat indool bij de geteste concentraties geen vacuolevorming induceerde in B. xylophilus (gegevens niet getoond). De resultaten bevestigden dus dat het indool-jodiumcomplex verantwoordelijk is voor de vacuolisatie en het metabolisme van B. xylophilus.
Van de geteste indolen op nematicide activiteit had 5-joodindool de hoogste slipindex van -5,89 kcal/mol, gevolgd door 7-joodindool (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindool (-4,33) en indool (-4,03) (Figuur 6). De sterke waterstofbinding van de hoofdketen van 5-joodindool aan leucine 218 stabiliseert de binding, terwijl alle andere indoolderivaten binden aan serine 260 via waterstofbindingen in de zijketen. Van de andere gemodelleerde jodoindolen heeft 2-jodoindool een bindingswaarde van -5,248 kcal/mol, wat te danken is aan de belangrijkste waterstofbinding met leucine 218. Andere bekende bindingen zijn onder andere 3-jodoindool (-4,3 kcal/mol), 4-jodoindool (-4,0 kcal/mol) en 6-fluorindool (-2,6 kcal/mol) (aanvullende figuur S8). De meeste gehalogeneerde indolen en indool zelf, met uitzondering van 5-joodindool en 2-joodindool, vormen een binding met serine 260. Het feit dat waterstofbinding met leucine 218 een indicatie is van efficiënte receptor-ligandbinding, zoals waargenomen voor ivermectine (aanvullende figuur S7), bevestigt dat 5-joodindool en 2-joodindool, net als ivermectine, stevig binden aan de actieve plaats van de GluCL-receptor via leucine 218 (figuur 6 en aanvullende figuur S8). We stellen voor dat deze binding nodig is om de open poriestructuur van het GluCL-complex te behouden en dat 5-joodindool, 2-joodindool, avermectine en ivermectine, door stevig te binden aan de actieve plaats van de GluCL-receptor, het ionenkanaal openhouden en vloeistofopname mogelijk maken.
Moleculaire docking van indool en gehalogeneerd indool aan GluCL. Bindingsoriëntaties van de liganden (A) indool, (B) 4-fluorindool, (C) 7-joodindool en (D) 5-joodindool aan de actieve site van GluCL. Het eiwit wordt weergegeven als een lint en de waterstofbruggen in de hoofdketen worden weergegeven als gele stippellijnen. (A′), (B′), (C′) en (D′) tonen de interacties van de corresponderende liganden met de omliggende aminozuurresiduen, en de waterstofbruggen in de zijketen worden aangegeven met roze stippelpijlen.
Er werden experimenten uitgevoerd om het toxische effect van 5-joodindool op de kieming van kool- en radijszaad te evalueren. 5-joodindool (0,05 of 0,1 mM) of avermectine (10 μg/mL) had weinig tot geen effect op de initiële kieming en de opkomst van de plantjes (Figuur 7). Bovendien werd er geen significant verschil gevonden tussen de kiemingssnelheid van onbehandelde controlezaden en zaden behandeld met 5-joodindool of avermectine. Het effect op de verlenging van de penwortel en het aantal gevormde zijwortels was onbeduidend, hoewel 1 mM (10 keer de actieve concentratie) van 5-joodindool de ontwikkeling van zijwortels enigszins vertraagde. Deze resultaten geven aan dat 5-joodindool niet giftig is voor plantencellen en de plantontwikkelingsprocessen bij de onderzochte concentraties niet verstoort.
Effect van 5-joodindool op zaadkieming. Kieming, uitlopen en zijwortelvorming van zaden van B. oleracea en R. raphanistrum op Murashige en Skoog-agar met of zonder avermectine of 5-joodindool. De kieming werd geregistreerd na 3 dagen incubatie bij 22 °C.
Deze studie beschrijft verschillende gevallen van het doden van nematoden door indolen. Belangrijk is dat dit het eerste rapport is over iodoindol dat methylering induceert (een proces veroorzaakt door de ophoping van kleine vacuolen die geleidelijk samensmelten tot gigantische vacuolen, wat uiteindelijk leidt tot membraanruptuur en dood) in dennennaalden, waarbij iodoindol significante nematicide eigenschappen vertoont die vergelijkbaar zijn met die van het commerciële nematicide avermectine.
Er is eerder gerapporteerd dat indolen meerdere signaalfuncties uitoefenen in prokaryoten en eukaryoten, waaronder biofilmremming/vorming, bacteriële overleving en pathogeniciteit19,32,33,34. Recentelijk hebben de potentiële therapeutische effecten van gehalogeneerde indolen, indoolalkaloïden en semisynthetische indoolderivaten veel onderzoeksaandacht getrokken35,36,37. Zo is bijvoorbeeld aangetoond dat gehalogeneerde indolen persistente Escherichia coli- en Staphylococcus aureus-cellen kunnen doden37. Daarnaast is het van wetenschappelijk belang om de werkzaamheid van gehalogeneerde indolen tegen andere soorten, geslachten en rijken te bestuderen, en deze studie is een stap in de richting van het bereiken van dit doel.
Hier stellen we een mechanisme voor dat de letaliteit van 5-jodoindool in C. elegans verklaart, gebaseerd op omkeerbare celbeschadiging (RCI) en methylering (figuren 4C en 5). Oedemateuze veranderingen zoals zwelling en vacuolaire degeneratie zijn indicatoren van RCI en methylering, die zich manifesteren als gigantische vacuolen in het cytoplasma48,49. RCI verstoort de energieproductie door de ATP-productie te verminderen, het falen van de ATPase-pomp te veroorzaken of celmembranen te verstoren en een snelle instroom van Na+, Ca2+ en water te veroorzaken50,51,52. Intracytoplasmatische vacuolen ontstaan in dierlijke cellen als gevolg van vochtophoping in het cytoplasma door de instroom van Ca2+ en water53. Interessant genoeg is dit mechanisme van celbeschadiging omkeerbaar als de schade tijdelijk is en de cellen gedurende een bepaalde periode ATP gaan produceren, maar als de schade aanhoudt of verergert, sterven de cellen.54 Onze waarnemingen tonen aan dat nematoden die behandeld zijn met 5-jodoindool niet in staat zijn de normale biosynthese te herstellen na blootstelling aan stressomstandigheden.
Het methyleringsfenotype dat door 5-joodindool in B. xylophilus wordt geïnduceerd, kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van jodium en de moleculaire distributie ervan, aangezien 7-joodindool een minder remmend effect had op B. xylophilus dan 5-joodindool (Tabel 1 en Aanvullende Figuur S6). Deze resultaten komen gedeeltelijk overeen met de studies van Maltese et al. (2014), die rapporteerden dat translocatie van de pyridylstikstofgroep in indool van de para- naar de meta-positie vacuolisatie, groeiremming en cytotoxiciteit in U251-cellen opheft, wat suggereert dat de interactie van het molecuul met een specifieke actieve plaats in het eiwit cruciaal is27,44,45. De interacties tussen indool of gehalogeneerde indolen en GluCL-receptoren die in dit onderzoek zijn waargenomen, ondersteunen dit idee, aangezien 5- en 2-joodindool sterker bleken te binden aan GluCL-receptoren dan de andere onderzochte indolen (Figuur 6 en Aanvullende Figuur S8). Het jodium op de tweede of vijfde positie van het indool bleek te binden aan leucine 218 van de GluCL-receptor via waterstofbruggen in de hoofdketen, terwijl andere gehalogeneerde indolen en indool zelf zwakke waterstofbruggen vormen met serine 260 in de zijketen (Figuur 6). We veronderstellen daarom dat de lokalisatie van het halogeen een belangrijke rol speelt bij het induceren van vacuolaire degeneratie, terwijl de sterke binding van 5-joodindool het ionenkanaal openhoudt, waardoor een snelle vloeistofinstroom en vacuoleruptuur mogelijk is. Het precieze werkingsmechanisme van 5-joodindool moet echter nog worden opgehelderd.
Voordat 5-joodindool in de praktijk wordt toegepast, moet het toxische effect ervan op planten worden geanalyseerd. Onze kiemproeven toonden aan dat 5-joodindool bij de onderzochte concentraties geen negatief effect had op de kieming of de daaropvolgende ontwikkelingsprocessen (Figuur 7). Deze studie biedt dus een basis voor het gebruik van 5-joodindool in de ecologische omgeving om de schadelijkheid van dennenaaltjes voor dennenbomen te bestrijden.
Uit eerdere onderzoeken is gebleken dat therapie op basis van indolen een potentiële aanpak vormt voor het probleem van antibioticaresistentie en kankerprogressie55. Bovendien bezitten indolen antibacteriële, antikanker-, antioxiderende, ontstekingsremmende, antidiabetische, antivirale, antiproliferatieve en antituberculose-eigenschappen en kunnen ze een veelbelovende basis vormen voor de ontwikkeling van geneesmiddelen56,57. Deze studie suggereert voor het eerst het potentiële gebruik van jodium als antiparasitair en anthelmintisch middel.
Avermectine werd dertig jaar geleden ontdekt en won in 2015 de Nobelprijs. Het wordt nog steeds actief gebruikt als anthelminticum. Door de snelle ontwikkeling van resistentie tegen avermectinen bij nematoden en insectenplagen is echter een alternatieve, goedkope en milieuvriendelijke strategie nodig om de infectie met dennennematoden te bestrijden. Deze studie beschrijft tevens het mechanisme waarmee 5-joodindool dennennematoden doodt en toont aan dat 5-joodindool een lage toxiciteit heeft voor plantencellen, wat goede vooruitzichten biedt voor toekomstige commerciële toepassingen.
Alle experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Yeungnam Universiteit in Gyeongsan, Korea, en de methoden werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de ethische commissie van de Yeungnam Universiteit.
Eierincubatie-experimenten werden uitgevoerd volgens vastgestelde procedures43. Om de uitkomstpercentages (HR) te bepalen, werden 1 dag oude volwassen nematoden (ongeveer 100 vrouwtjes en 100 mannetjes) overgebracht naar petrischalen met de schimmel en gedurende 24 uur gekweekt. Vervolgens werden de eieren geïsoleerd en behandeld met 5-joodindool (0,05 mM en 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) als suspensie in steriel gedestilleerd water. Deze suspensies (500 μl; ongeveer 100 eieren) werden overgebracht naar de putjes van een 24-wells weefselkweekplaat en geïncubeerd bij 22 °C. Na 24 uur incubatie werden de L2-larven geteld, maar werden als dood beschouwd als de cellen niet bewogen bij stimulatie met een fijne platina draad. Dit experiment werd in twee fasen uitgevoerd, elk met zes herhalingen. De gegevens van beide experimenten werden gecombineerd en gepresenteerd. Het percentage HR wordt als volgt berekend:
De larvensterfte werd beoordeeld met behulp van eerder ontwikkelde procedures. Nematode-eieren werden verzameld en embryo's werden gesynchroniseerd door ze in steriel gedestilleerd water uit te laten komen om L2-larven te genereren. Gesynchroniseerde larven (ongeveer 500 nematoden) werden behandeld met 5-joodindol (0,05 mM en 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) en gekweekt op B. cinerea-petrischalen. Na 48 uur incubatie bij 22 °C werden de nematoden verzameld in steriel gedestilleerd water en onderzocht op de aanwezigheid van L2-, L3- en L4-stadia. De aanwezigheid van L3- en L4-stadia duidde op larvale transformatie, terwijl de aanwezigheid van het L2-stadium duidde op geen transformatie. Beelden werden verkregen met behulp van het iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dit experiment werd in twee fasen uitgevoerd, elk met zes herhalingen. De gegevens van beide experimenten werden gecombineerd en gepresenteerd.
De toxiciteit van 5-joodindool en avermectine voor zaden werd beoordeeld met behulp van kiemproeven op Murashige en Skoog-agarplaten.62 Zaden van B. oleracea en R. raphanistrum werden eerst een dag geweekt in steriel gedestilleerd water, gewassen met 1 ml 100% ethanol, gesteriliseerd met 1 ml 50% commercieel bleekmiddel (3% natriumhypochloriet) gedurende 15 minuten en vijfmaal gewassen met 1 ml steriel water. De gesteriliseerde zaden werden vervolgens op kiemagarplaten gedrukt die 0,86 g/l (0,2X) Murashige en Skoog-medium en 0,7% bacteriologische agar bevatten, met of zonder 5-joodindool of avermectine. De platen werden vervolgens geïncubeerd bij 22 °C en na 3 dagen incubatie werden afbeeldingen genomen. Dit experiment werd in twee fasen uitgevoerd, elk met zes herhalingen.
Geplaatst op: 26 februari 2025