De dennenaaltje is een quarantaine migrerende endoparasiet waarvan bekend is dat hij ernstige economische verliezen veroorzaakt in ecosystemen van dennenbossen. Deze studie beoordeelt de nematicide activiteit van gehalogeneerde indolen tegen dennenaaltjes en hun werkingsmechanisme. De nematicide activiteit van 5-joodindol en avermectine (positieve controle) tegen dennenaaltjes was vergelijkbaar en hoog bij lage concentraties (10 μg/ml). 5-joodindol verminderde de vruchtbaarheid, reproductieve activiteit, embryonale en larvale sterfte, en het bewegingsgedrag. Moleculaire interacties van liganden met invertebraten-specifieke glutamaat-gestuurde chloridekanaalreceptoren ondersteunen de theorie dat 5-joodindol, net als avermectine, zich sterk bindt aan de actieve plaats van de receptor. 5-joodindol induceerde ook verschillende fenotypische vervormingen bij nematoden, waaronder abnormale orgaancollaps/krimp en verhoogde vacuolisatie. Deze resultaten suggereren dat vacuolen een rol kunnen spelen bij de methylering-gemedieerde dood van nematoden. Belangrijk is dat 5-joodindol niet giftig was voor beide plantensoorten (kool en radijs). Deze studie toont dus aan dat de toepassing van joodindol onder omgevingsomstandigheden de dennenverwelkingsziekte kan bestrijden.
Dennenaaltjes (Bursaphelenchus xylophilus) behoren tot de dennenaaltjes (PWN), migrerende endoparasitaire nematoden waarvan bekend is dat ze ernstige ecologische schade aanrichten aan ecosystemen in dennenbossen1. De dennenverwelkingsziekte (PWD), veroorzaakt door de dennenaaltjes, wordt een ernstig probleem op verschillende continenten, waaronder Azië en Europa, en in Noord-Amerika vernietigt de nematode geïntroduceerde dennensoorten1,2. De achteruitgang van dennenbomen is een groot economisch probleem en de vooruitzichten van wereldwijde verspreiding zijn zorgwekkend3. De volgende dennensoorten worden het vaakst door de nematode aangevallen: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii en Pinus radiata4. Dennenaaltjes zijn een ernstige ziekte die dennenbomen binnen enkele weken of maanden na infectie kan doden. Bovendien komen uitbraken van dennenaaltjes vaak voor in uiteenlopende ecosystemen, waardoor hardnekkige infectieketens zijn ontstaan1.
Bursaphelenchus xylophilus is een quarantaine-plantenparasitaire nematode die behoort tot de superfamilie Aphelenchoidea en clade 102.5. De nematode voedt zich met schimmels en plant zich voort in het houtweefsel van dennenbomen, waarbij hij zich ontwikkelt tot vier verschillende larvale stadia: L1, L2, L3, L4 en een volwassen exemplaar1,6. Bij voedseltekort gaat de dennenaaltje over in een gespecialiseerd larvaal stadium – dauer – dat zijn vector – de dennenbastkever (Monochamus alternatus) – parasiteert en wordt overgebracht op gezonde dennenbomen. In gezonde gastheren migreren nematoden snel door plantenweefsels en voeden zich met parenchymateuze cellen, wat leidt tot een aantal overgevoeligheidsreacties, verwelking en de dood van de dennenbomen binnen een jaar na infectie1,7,8.
De biologische bestrijding van dennenaaltjes is al lang een uitdaging, met quarantainemaatregelen die teruggaan tot de 20e eeuw. Huidige strategieën voor de bestrijding van dennenaaltjes omvatten voornamelijk chemische behandelingen, waaronder houtfumigatie en het implanteren van nematiciden in boomstammen. De meest gebruikte nematiciden zijn avermectine en avermectinebenzoaat, die behoren tot de avermectinefamilie. Deze dure chemicaliën zijn zeer effectief tegen veel nematodensoorten en worden als milieuvriendelijk beschouwd9. Herhaald gebruik van deze nematiciden zal echter naar verwachting selectiedruk creëren die vrijwel zeker zal leiden tot het ontstaan van resistente dennenaaltjes, zoals is aangetoond voor verschillende insectenplagen, zoals Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella en de nematoden Trichostrongylus colubriformis en Ostertagia circumcincta, die geleidelijk resistentie tegen avermectines hebben ontwikkeld10,11,12. Daarom moeten resistentiepatronen regelmatig worden bestudeerd en moeten nematiciden continu worden gescreend om alternatieve, kosteneffectieve en milieuvriendelijke maatregelen te vinden om PVD te bestrijden. In de afgelopen decennia hebben verschillende auteurs het gebruik van plantenextracten, etherische oliën en vluchtige stoffen voorgesteld als bestrijdingsmiddelen tegen nematoden13,14,15,16.
We hebben onlangs de nematicide activiteit van indool, een intercellulair en interkingdom signaalmolecuul, aangetoond in Caenorhabditis elegans 17 . Indool is een wijdverbreid intracellulair signaal in microbiële ecologie, dat talrijke functies controleert die de microbiële fysiologie, sporenvorming, plasmidestabiliteit, geneesmiddelresistentie, biofilmvorming en virulentie beïnvloeden 18, 19 . De activiteit van indool en zijn derivaten tegen andere pathogene nematoden is niet onderzocht. In deze studie onderzochten we de nematicide activiteit van 34 indolen tegen dennenaaltjes en verduidelijkten we het werkingsmechanisme van de meest krachtige 5-joodindool met behulp van microscopie, time-lapse fotografie en moleculaire docking experimenten, en beoordeelden we de toxische effecten ervan op planten met behulp van een zaadkiemingstest.
Hoge concentraties (> 1,0 mM) indool blijken eerder een nematicide werking te hebben op nematoden17. Na behandeling van B. xylophilus (gemengde levensstadia) met indool of 33 verschillende indoolderivaten bij 1 mM, werd de mortaliteit van B. xylophilus gemeten door het aantal levende en dode nematoden in de controlegroep en de behandelde groep te tellen. Vijf indolen vertoonden significante nematicide activiteit; de overleving van de onbehandelde controlegroep was 95 ± 7% na 24 uur. Van de 34 geteste indolen veroorzaakten 5-joodindool en 4-fluorindool bij 1 mM 100% mortaliteit, terwijl 5,6-difluorindigo, methylindool-7-carboxylaat en 7-joodindool ongeveer 50% mortaliteit veroorzaakten (tabel 1).
Effect van 5-joodindol op vacuolevorming en metabolisme van dennenaaltjes. (A) Effect van avermectine en 5-joodindol op volwassen mannelijke nematoden, (B) eieren van nematoden in stadium L1 en (C) metabolisme van B. xylophilus. (i) vacuolen werden niet waargenomen na 0 uur, behandeling resulteerde in (ii) vacuolen, (iii) accumulatie van meerdere vacuolen, (iv) zwelling van vacuolen, (v) fusie van vacuolen en (vi) vorming van reuzenvacuolen. Rode pijlen geven zwelling van vacuolen aan, blauwe pijlen geven fusie van vacuolen aan en zwarte pijlen geven reuzenvacuolen aan. Schaalbalk = 50 μm.
Bovendien beschreef deze studie ook het sequentiële proces van methaan-geïnduceerde celdood in dennenaaltjes (Figuur 4C). Methanogene celdood is een niet-apoptotisch type celdood geassocieerd met de accumulatie van prominente cytoplasmatische vacuolen27. De morfologische defecten die in dennenaaltjes werden waargenomen, lijken nauw verband te houden met het mechanisme van methaan-geïnduceerde celdood. Microscopisch onderzoek op verschillende tijdstippen toonde aan dat er gigantische vacuolen werden gevormd na 20 uur blootstelling aan 5-joodindol (0,1 mM). Microscopische vacuolen werden waargenomen na 8 uur behandeling en hun aantal nam toe na 12 uur. Verschillende grote vacuolen werden waargenomen na 14 uur. Verschillende gefuseerde vacuolen waren duidelijk zichtbaar na 12-16 uur behandeling, wat aangeeft dat vacuolefusie de basis is van het methanogene celdoodmechanisme. Na 20 uur werden er verschillende gigantische vacuolen door de hele worm gevonden. Deze waarnemingen vormen de eerste melding van metuosis bij C. elegans.
Bij met 5-joodindol behandelde wormen werden ook vacuole-aggregatie en -ruptuur waargenomen (Fig. 5), zoals blijkt uit het buigen van de worm en het vrijkomen van vacuoles in de omgeving. Vacuole-ruptuur werd ook waargenomen in het eierschaalmembraan, dat normaal gesproken intact blijft door L2 tijdens het uitkomen (Aanvullende Fig. S2). Deze waarnemingen ondersteunen de betrokkenheid van vochtophoping en osmoregulatiefalen, evenals reversibele celbeschadiging (RCI), bij de vorming en ettervorming van vacuoles (Fig. 5).
Vanuit de hypothese van de rol van jodium in de waargenomen vacuolevorming onderzochten we de nematicide activiteit van natriumjodide (NaI) en kaliumjodide (KI). Bij concentraties (0,1, 0,5 of 1 mM) hadden ze echter geen invloed op de overleving of vacuolevorming van de nematoden (aanvullende figuur S5), hoewel 1 mM KI een licht nematicide effect had. Daarentegen induceerde 7-joodindol (1 of 2 mM), net als 5-joodindol, meerdere vacuolen en structurele vervormingen (aanvullende figuur S6). De twee joodindolen vertoonden vergelijkbare fenotypische kenmerken in dennenaaltjes, terwijl NaI en KI dat niet deden. Interessant is dat indol geen vacuolevorming induceerde in B. xylophilus bij de geteste concentraties (gegevens niet getoond). De resultaten bevestigden dus dat het indool-jodiumcomplex verantwoordelijk is voor de vacuolisatie en het metabolisme van B. xylophilus.
Van de indolen die getest werden op nematicide-activiteit, had 5-joodindol de hoogste slipindex van -5,89 kcal/mol, gevolgd door 7-joodindol (-4,48 kcal/mol), 4-fluorindol (-4,33 kcal/mol) en indol (-4,03 kcal/mol) (Figuur 6). De sterke waterstofbinding in de ruggengraat van 5-joodindol aan leucine 218 stabiliseert de binding, terwijl alle andere indolderivaten zich via waterstofbruggen in de zijketen aan serine 260 binden. Onder andere gemodelleerde joodindolen heeft 2-joodindol een bindingswaarde van -5,248 kcal/mol, wat te danken is aan de belangrijkste waterstofbinding met leucine 218. Andere bekende bindingen zijn onder meer 3-joodindol (-4,3 kcal/mol), 4-joodindol (-4,0 kcal/mol) en 6-fluorindol (-2,6 kcal/mol) (Aanvullende figuur S8). De meeste gehalogeneerde indolen en indol zelf, met uitzondering van 5-joodindol en 2-joodindol, vormen een binding met serine 260. Het feit dat waterstofbruggen met leucine 218 wijzen op een efficiënte receptor-ligandbinding, zoals waargenomen voor ivermectine (aanvullende figuur S7), bevestigt dat 5-joodindol en 2-joodindol, net als ivermectine, zich via leucine 218 sterk binden aan de actieve plaats van de GluCL-receptor (figuur 6 en aanvullende figuur S8). Wij stellen voor dat deze binding nodig is om de open poriënstructuur van het GluCL-complex te behouden en dat 5-joodindol, 2-joodindol, avermectine en ivermectine door hun sterke binding aan de actieve plaats van de GluCL-receptor het ionenkanaal open houden en vochtopname mogelijk maken.
Moleculaire koppeling van indool en gehalogeneerd indool aan GluCL. Bindingsoriëntaties van (A) indool-, (B) 4-fluorindool-, (C) 7-joodindool- en (D) 5-joodindoolliganden aan de actieve plaats van GluCL. Het eiwit wordt weergegeven door een lint en de waterstofbruggen in de ruggengraat zijn weergegeven als gele stippellijnen. (A′), (B′), (C′) en (D′) tonen de interacties van de corresponderende liganden met de omliggende aminozuren, en de waterstofbruggen in de zijketen zijn aangegeven met roze stippelpijlen.
Er werden experimenten uitgevoerd om het toxische effect van 5-joodindol op de kieming van kool- en radijszaad te evalueren. 5-joodindol (0,05 of 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) had weinig tot geen effect op de initiële kieming en de opkomst van plantjes (Figuur 7). Bovendien werd er geen significant verschil gevonden tussen de kiemkracht van onbehandelde controles en zaden behandeld met 5-joodindol of avermectine. Het effect op de strekking van de penwortel en het aantal gevormde zijwortels was onbeduidend, hoewel 1 mM (10 keer de actieve concentratie) 5-joodindol de ontwikkeling van zijwortels enigszins vertraagde. Deze resultaten geven aan dat 5-joodindol niet toxisch is voor plantencellen en de ontwikkelingsprocessen van planten niet verstoort bij de bestudeerde concentraties.
Effect van 5-joodindol op zaadkieming. Kieming, spruitvorming en laterale beworteling van B. oleracea- en R. raphanistrum-zaden op Murashige- en Skoog-agarmedium met of zonder avermectine of 5-joodindol. De kieming werd geregistreerd na 3 dagen incubatie bij 22 °C.
Deze studie rapporteert verschillende gevallen van nematodendoding door indolen. Belangrijk is dat dit de eerste keer is dat joodindol methylering induceert (een proces dat wordt veroorzaakt door de ophoping van kleine vacuolen die geleidelijk samensmelten tot gigantische vacuolen, wat uiteindelijk leidt tot membraanbreuk en -dood) in dennennaalden. Joodindol vertoont hierbij significante nematicide-eigenschappen die vergelijkbaar zijn met die van de commerciële nematicide avermectine.
Van indolen is eerder gerapporteerd dat ze meerdere signaalfuncties uitoefenen in prokaryoten en eukaryoten, waaronder de remming/vorming van biofilms, bacteriële overleving en pathogeniciteit19,32,33,34. Recentelijk hebben de potentiële therapeutische effecten van gehalogeneerde indolen, indoolalkaloïden en semisynthetische indoolderivaten veel aandacht getrokken in wetenschappelijk onderzoek35,36,37. Zo is aangetoond dat gehalogeneerde indolen persistente cellen van Escherichia coli en Staphylococcus aureus doden37. Daarnaast is het wetenschappelijk interessant om de werkzaamheid van gehalogeneerde indolen tegen andere soorten, geslachten en koninkrijken te bestuderen, en deze studie is een stap in de richting van dit doel.
We stellen hier een mechanisme voor 5-joodindol-geïnduceerde letaliteit in C. elegans voor, gebaseerd op reversibele celbeschadiging (RCI) en methylering (figuren 4C en 5). Oedemateuze veranderingen zoals zwelling en vacuolaire degeneratie zijn indicatoren van RCI en methylering, die zich manifesteren als gigantische vacuolen in het cytoplasma48,49. RCI verstoort de energieproductie door de ATP-productie te verminderen, wat leidt tot uitval van de ATPase-pomp, of door celmembranen te verstoren en een snelle instroom van Na+, Ca2+ en water te veroorzaken50,51,52. Intracytoplasmatische vacuolen ontstaan in dierlijke cellen als gevolg van vochtophoping in het cytoplasma door de instroom van Ca2+ en water53. Interessant genoeg is dit mechanisme van celschade omkeerbaar als de schade tijdelijk is en de cellen gedurende een bepaalde tijd ATP beginnen te produceren. Als de schade echter aanhoudt of erger wordt, sterven de cellen af.54 Uit onze observaties blijkt dat nematoden die met 5-joodindol worden behandeld, na blootstelling aan stressomstandigheden hun normale biosynthese niet kunnen herstellen.
Het methyleringsfenotype dat door 5-joodindol in B. xylophilus wordt geïnduceerd, kan te wijten zijn aan de aanwezigheid van jodium en de moleculaire distributie ervan, aangezien 7-joodindol een minder remmend effect had op B. xylophilus dan 5-joodindol (tabel 1 en aanvullende figuur S6). Deze resultaten komen gedeeltelijk overeen met de studies van Maltese et al. (2014), die rapporteerden dat translocatie van de pyridylstikstofgroep in indol van de para- naar de meta-positie vacuolisatie, groeiremming en cytotoxiciteit in U251-cellen tenietdeed, wat suggereert dat de interactie van het molecuul met een specifieke actieve plaats in het eiwit cruciaal is27,44,45. De interacties tussen indool of gehalogeneerde indolen en GluCL-receptoren die in deze studie werden waargenomen, ondersteunen deze theorie eveneens, aangezien 5- en 2-joodindol sterker aan GluCL-receptoren bleken te binden dan de andere onderzochte indolen (Figuur 6 en Aanvullende Figuur S8). Het jodium op de tweede of vijfde positie van het indool bleek via waterstofbruggen in de ruggengraat aan leucine 218 van de GluCL-receptor te binden, terwijl andere gehalogeneerde indolen en indool zelf zwakke zijketenwaterstofbruggen vormen met serine 260 (Figuur 6). We vermoeden daarom dat de lokalisatie van het halogeen een belangrijke rol speelt bij de inductie van vacuolaire degeneratie, terwijl de sterke binding van 5-joodindol het ionenkanaal openhoudt, waardoor snelle vloeistofinstroom en vacuoleruptuur mogelijk worden. Het gedetailleerde werkingsmechanisme van 5-joodindol moet echter nog worden bepaald.
Voordat 5-joodindol praktisch kan worden toegepast, moet het toxische effect ervan op planten worden geanalyseerd. Onze experimenten met zaadkieming toonden aan dat 5-joodindol geen negatief effect had op de zaadkieming of de daaropvolgende ontwikkelingsprocessen bij de bestudeerde concentraties (Figuur 7). Deze studie biedt daarom een basis voor het gebruik van 5-joodindol in de ecologische omgeving om de schadelijkheid van dennenaaltjes voor dennenbomen te bestrijden.
Eerdere rapporten hebben aangetoond dat indolentherapie een potentiële aanpak is om het probleem van antibioticaresistentie en kankerprogressie aan te pakken55. Bovendien bezitten indolen antibacteriële, antikanker-, antioxiderende, ontstekingsremmende, antidiabetische, antivirale, antiproliferatieve en antituberculose-eigenschappen en kunnen ze een veelbelovende basis vormen voor geneesmiddelenontwikkeling56,57. Deze studie suggereert voor het eerst het potentiële gebruik van jodium als antiparasitair en anthelmintisch middel.
Avermectine werd drie decennia geleden ontdekt en won in 2015 de Nobelprijs. Het wordt nog steeds actief gebruikt als ontwormingsmiddel. Vanwege de snelle ontwikkeling van resistentie tegen avermectines bij nematoden en insectenplagen is er echter behoefte aan een alternatieve, goedkope en milieuvriendelijke strategie om PWN-infectie in dennenbomen te bestrijden. Deze studie beschrijft ook het mechanisme waarmee 5-jodoindol dennenaaltjes doodt en dat 5-jodoindol een lage toxiciteit heeft voor plantencellen, wat goede vooruitzichten biedt voor toekomstige commerciële toepassing.
Alle experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Yeungnam-universiteit in Gyeongsan, Korea. De methoden werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de ethische commissie van de Yeungnam-universiteit.
Incubatie-experimenten met eieren werden uitgevoerd volgens vastgestelde procedures43. Om de uitkomstpercentages (HR) te bepalen, werden 1 dag oude volwassen nematoden (ongeveer 100 vrouwtjes en 100 mannetjes) overgebracht naar petrischalen met de schimmel en 24 uur laten groeien. De eieren werden vervolgens geïsoleerd en behandeld met 5-joodindol (0,05 mM en 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) als suspensie in steriel gedestilleerd water. Deze suspensies (500 μl; ongeveer 100 eieren) werden overgebracht naar de wells van een 24-wells weefselkweekplaat en geïncubeerd bij 22 °C. L2-tellingen werden uitgevoerd na 24 uur incubatie, maar werden als dood beschouwd als de cellen niet bewogen bij stimulatie met een fijne platinadraad. Dit experiment werd uitgevoerd in twee fasen, elk met zes herhalingen. De gegevens van beide experimenten werden gecombineerd en gepresenteerd. Het percentage HR wordt als volgt berekend:
De larvensterfte werd beoordeeld met behulp van eerder ontwikkelde procedures. Nematode-eieren werden verzameld en embryo's werden gesynchroniseerd door ze uit te laten komen in steriel gedestilleerd water om L2-larven te genereren. Gesynchroniseerde larven (ongeveer 500 nematoden) werden behandeld met 5-joodindol (0,05 mM en 0,1 mM) of avermectine (10 μg/ml) en gekweekt op B. cinerea petrischalen. Na 48 uur incubatie bij 22 °C werden de nematoden verzameld in steriel gedestilleerd water en onderzocht op de aanwezigheid van L2-, L3- en L4-stadia. De aanwezigheid van L3- en L4-stadia duidde op larvale transformatie, terwijl de aanwezigheid van het L2-stadium aangaf dat er geen transformatie had plaatsgevonden. Beelden werden verkregen met behulp van het iRiS™ Digital Cell Imaging System. Dit experiment werd uitgevoerd in twee fasen, elk met zes herhalingen. De gegevens van beide experimenten werden gecombineerd en gepresenteerd.
De toxiciteit van 5-joodindol en avermectine voor zaden werd beoordeeld met behulp van kiemtesten op Murashige- en Skoog-agarplaten. 62 B. oleracea- en R. raphanistrum-zaden werden eerst één dag geweekt in steriel gedestilleerd water, gewassen met 1 ml 100% ethanol, gesteriliseerd met 1 ml 50% commercieel bleekmiddel (3% natriumhypochloriet) gedurende 15 minuten en vijf keer gewassen met 1 ml steriel water. De gesteriliseerde zaden werden vervolgens geperst op kiemagarplaten met 0,86 g/l (0,2X) Murashige- en Skoog-medium en 0,7% bacteriologische agar met of zonder 5-joodindol of avermectine. De platen werden vervolgens geïncubeerd bij 22 °C en na 3 dagen incubatie werden er beelden gemaakt. Dit experiment werd uitgevoerd in twee fasen, elk met zes herhalingen.
Geplaatst op: 26-02-2025