Plantaardig en pathogeen materiaal
Een sorghum-associatie-mappingpopulatie, bekend als de sorghum-conversiepopulatie (SCP), werd beschikbaar gesteld door Dr. Pat Brown van de Universiteit van Illinois (nu UC Davis). Deze populatie is eerder beschreven en bestaat uit een verzameling diverse lijnen die zijn omgezet naar fotoperiode-ongevoeligheid en een kleinere gestalte om de groei en ontwikkeling van de planten in Amerikaanse omstandigheden te bevorderen. 510 lijnen uit deze populatie werden gebruikt in dit onderzoek, hoewel vanwege slechte kieming en andere kwaliteitscontroleproblemen niet alle lijnen werden gebruikt voor de analyse van alle drie de eigenschappen. Uiteindelijk werden gegevens van 345 lijnen gebruikt voor de analyse van de chitine-respons, 472 lijnen voor de flg22-respons en 456 voor TLS-resistentie.B. cookeiStam LSLP18 werd verkregen van Dr. Burt Bluhm aan de Universiteit van Arkansas.
MAMP-responsmeting
In deze studie werden twee verschillende MAMP's gebruikt: flg22 (Genscript catalogusnummer RP19986) en chitine. Sorghumplanten werden gekweekt in inzetstukken die op trays met aarde (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) in de kas waren geplaatst. De planten werden de dag vóór de monstername bewaterd om te voorkomen dat de bladeren op de dag van de monstername te vochtig zouden zijn.
De lijnen werden gerandomiseerd en, om logistieke redenen, in batches van 60 lijnen geplant. Voor elke lijn werden drie 'potten' beplant met twee zaden per lijn. De volgende batches werden geplant zodra de vorige batch was verwerkt, totdat de gehele populatie was beoordeeld. Er werden twee experimentele runs uitgevoerd voor beide MAMP's, waarbij de genotypen in elk van de twee runs opnieuw werden gerandomiseerd.
ROS-testen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven. Kort gezegd werden voor elke lijn zes zaden in drie verschillende potten geplant. Van de resulterende zaailingen werden er drie geselecteerd op basis van uniformiteit. Zaailingen die er ongebruikelijk uitzagen of significant langer of korter waren dan de meerderheid werden niet gebruikt. Vier bladschijfjes met een diameter van 3 mm werden uitgesneden uit het breedste deel van het vierde blad van drie verschillende 15 dagen oude sorghumplanten. Eén schijfje per blad van twee planten en twee schijfjes van één plant, waarbij het tweede schijfje als watercontrole diende (zie hieronder). De schijfjes werden afzonderlijk in 50 µl H2O in een zwarte 96-wells plaat gelegd, afgesloten met een aluminium deksel om blootstelling aan licht te voorkomen, en een nacht op kamertemperatuur bewaard. De volgende ochtend werd een reactieoplossing gemaakt met 2 mg/ml chemiluminescentieprobe L-012 (Wako, catalogusnr. 120-04891), 2 mg/ml mierrettichperoxidase (Type VI-A, Sigma-Aldrich, catalogusnr. P6782) en 100 mg/ml chitine of 2 μM Flg22. 50 µl van deze reactieoplossing werd toegevoegd aan drie van de vier putjes. Het vierde putje diende als controle, waaraan de reactieoplossing zonder MAMP werd toegevoegd. Elke plaat bevatte ook vier blanco putjes met alleen water.
Na toevoeging van de reactieoplossing werd de luminescentie elke 2 minuten gedurende 1 uur gemeten met behulp van een SynergyTM 2 multi-detectie microplaatlezer (BioTek). De plaatlezer registreerde de luminescentie elke 2 minuten gedurende dit uur. De som van alle 31 metingen werd berekend om de waarde voor elk putje te bepalen. De geschatte waarde voor de MAMP-respons voor elk genotype werd berekend als (gemiddelde luminescentiewaarde van de drie experimentele putjes - de waarde van het controleputje) - min de gemiddelde waarde van het blanco putje. De waarden van het blanco putje lagen consistent dicht bij nul.
Bladschijven vanNicotiana benthamianaDaarnaast werden in elke 96-wells plaat ook een zeer responsieve sorghumlijn (SC0003) en een minder responsieve sorghumlijn (PI 6069) als controles opgenomen voor kwaliteitscontrole.
B. cookeibereiding en inoculatie van het inoculum
B. cookeiHet inoculum werd bereid zoals eerder beschreven. Kort gezegd werden sorghumkorrels drie dagen in water geweekt, afgespoeld, in conische kolven van 1 liter gedaan en gedurende een uur geautoclaveerd bij 15 psi en 121 °C. De korrels werden vervolgens geïnoculeerd met ongeveer 5 ml gemacereerd mycelium uit een verse kweek vanB. cookeiLSLP18-isolaten werden gedurende twee weken bij kamertemperatuur bewaard, waarbij de kolven om de drie dagen werden geschud. Na twee weken werden de met schimmels geïnfecteerde sorghumkorrels aan de lucht gedroogd en vervolgens bewaard bij 4 °C tot de veldinoculatie. Voor de gehele proef werd hetzelfde inoculum gebruikt, dat elk jaar opnieuw werd bereid. Voor de inoculatie werden 6-10 geïnfecteerde korrels in de bladschede van 4-5 weken oude sorghumplanten geplaatst. De sporen die door deze schimmels werden geproduceerd, initieerden binnen een week een infectie in de jonge sorghumplanten.
Zaadvoorbereiding
Voordat de sorghumzaden in het veld werden gezaaid, werden ze behandeld met een mengsel van fungicide, insecticide en zaadbeschermer, bestaande uit ongeveer 1% Spirato 480 FS fungicide, 4% Sebring 480 FS fungicide en 3% Sorpro 940 ES zaadbeschermer. Vervolgens werden de zaden 3 dagen aan de lucht gedroogd, waardoor een dunne laag van dit mengsel rond de zaden ontstond. De zaadbeschermer maakte het mogelijk om het herbicide Dual Magnum als voorbehandeling te gebruiken.
Evaluatie van de resistentie tegen bladvlekkenziekte
Het SCP-ras werd op 14-15 juni 2017 en 20 juni 2018 geplant op het Central Crops Research Station in Clayton, North Carolina, volgens een gerandomiseerd compleet blokontwerp met twee herhalingen per experiment. De experimenten werden uitgevoerd in enkele rijen van 1,8 m lang en 0,9 m breed, met 10 zaden per perceel. Om randeffecten te voorkomen, werden twee randrijen rond de periferie van elk experiment geplant. De experimenten werden geïnoculeerd op 20 juli 2017 en 20 juli 2018, toen de sorghumplanten zich in groeistadium 3 bevonden. De ziekteverschijnselen werden beoordeeld op een schaal van één tot negen, waarbij planten zonder ziekteverschijnselen een negen kregen en volledig dode planten een één. In 2017 werden twee beoordelingen uitgevoerd en in 2018 vier, telkens twee weken na de inoculatie. De gestandaardiseerde oppervlakte onder de ziekteprogressiecurve (sAUDPC) werd berekend zoals eerder beschreven.
Geplaatst op: 1 april 2021