Planten- en ziekteverwekkermaterialen
Een populatie voor het in kaart brengen van sorghum, bekend als de sorghum conversion population (SCP), werd aangeleverd door Dr. Pat Brown van de Universiteit van Illinois (nu aan de UC Davis). Deze populatie is eerder beschreven en bestaat uit een verzameling diverse lijnen die zijn omgezet naar fotoperiode-ongevoeligheid en een kleinere lengte hebben om de groei en ontwikkeling van de planten in Amerikaanse omgevingen te bevorderen. 510 lijnen van deze populatie werden in deze studie gebruikt, hoewel vanwege slechte kieming en andere kwaliteitscontroleproblemen niet alle lijnen werden gebruikt voor de analyse van alle drie de eigenschappen. Uiteindelijk werden gegevens van 345 lijnen gebruikt voor de analyse van de chitinerespons, 472 lijnen voor de flg22-respons en 456 voor TLS-resistentie.B. koekjestam LSLP18 werd verkregen van Dr. Burt Bluhm van de Universiteit van Arkansas.
MAMP-responsmeting
In deze studie werden twee verschillende MAMP's gebruikt (flg22, Genscript catalogusnr. RP19986) en chitine. Sorghumplanten werden gekweekt in inzetstukken op met aarde (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) gevulde platen in de kas. De planten werden de dag vóór de monstername bewaterd om extra bladvocht op de dag van monstername te voorkomen.
De lijnen werden gerandomiseerd en om logistieke redenen in groepen van 60 lijnen geplant. Per lijn werden drie 'potten' geplant met twee zaden per lijn. Volgende groepen werden geplant zodra de vorige groep was verwerkt, totdat de volledige populatie was beoordeeld. Er werden twee experimentele runs uitgevoerd voor beide MAMP's, waarbij de genotypes in elk van de twee runs opnieuw werden gerandomiseerd.
ROS-testen werden uitgevoerd zoals eerder beschreven. Kort gezegd werden voor elke lijn zes zaden in drie verschillende potten geplant. Uit de resulterende zaailingen werden er drie geselecteerd op basis van uniformiteit. Zaailingen die er ongebruikelijk uitzagen of aanzienlijk hoger of lager waren dan de meerderheid, werden niet gebruikt. Vier bladschijfjes met een diameter van 3 mm werden uit het breedste deel van het vierde blad van drie verschillende 15 dagen oude sorghumplanten gesneden. Eén schijfje per blad van twee planten en twee schijfjes van één plant, waarbij het tweede schijfje als watercontrole diende (zie hieronder). De schijfjes werden individueel op 50 µl H2O in een zwarte 96-wells plaat geplaatst, afgesloten met een aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen, en een nacht bij kamertemperatuur bewaard. De volgende ochtend werd een reactieoplossing gemaakt met 2 mg/ml chemiluminescentieprobe L-012 (Wako, catalogusnr. 120-04891), 2 mg/ml mierikswortelperoxidase (type VI-A, Sigma-Aldrich, catalogusnr. P6782) en 100 mg/ml chitine of 2 μM Flg22. 50 µl van deze reactieoplossing werd toegevoegd aan drie van de vier putjes. Het vierde putje was een schijncontrole, waaraan de reactieoplossing exclusief de MAMP werd toegevoegd. In elke plaat werden ook vier blanco putjes met alleen water opgenomen.
Na het toevoegen van de reactieoplossing werd de luminescentie gedurende 1 uur elke 2 minuten gemeten met een SynergyTM 2 multi-detection microplate reader (BioTek). De plate reader voert gedurende dit uur elke 2 minuten luminescentiemetingen uit. De som van alle 31 metingen werd berekend om de waarde voor elke well te bepalen. De geschatte waarde voor de MAMP-respons voor elk genotype werd berekend als (de gemiddelde luminescentiewaarde van de drie experimentele wells – de mock well-waarde) minus de gemiddelde blanco well-waarde. De blanco well-waarden lagen consistent dicht bij nul.
Bladschijven vanNicotiana benthamiana, één hoog responsieve sorghumlijn (SC0003) en één laag responsieve sorghumlijn (PI 6069) werden ook opgenomen als controles in elke 96-wellsplaat voor kwaliteitscontroledoeleinden.
B. koekjeinoculumbereiding en inoculatie
B. koekjeHet inoculum werd bereid zoals eerder beschreven. Kort gezegd werden de sorghumkorrels drie dagen in water geweekt, gespoeld, in erlenmeyers van 1 liter geschept en een uur geautoclaveerd bij 15 psi en 121 °C. De korrels werden vervolgens geënt met ongeveer 5 ml gemacereerd mycelium uit een verse kweek vanB. koekjeLSLP18-isolaten werden gedurende 2 weken bij kamertemperatuur bewaard, waarbij de kolven om de 3 dagen werden geschud. Na 2 weken werden de met schimmel besmette sorghumkorrels aan de lucht gedroogd en vervolgens bij 4 °C bewaard tot de inoculatie in het veld. Hetzelfde inoculum werd gedurende de gehele proef gebruikt en jaarlijks vers aangemaakt. Voor de inoculatie werden 6-10 besmette korrels in de krans van 4-5 weken oude sorghumplanten geplaatst. De sporen die door deze schimmels werden geproduceerd, initieerden binnen een week een infectie in de jonge sorghumplanten.
Zaadvoorbereiding
Voordat het sorghumzaad op het veld werd geplant, werd het behandeld met een mengsel van fungicide, insecticide en safener, bestaande uit ~ 1% Spirato 480 FS fungicide, 4% Sebring 480 FS fungicide en 3% Sorpro 940 ES zaadsafener. Vervolgens werden de zaden 3 dagen aan de lucht gedroogd, waardoor een dunne laag van dit mengsel rond de zaden ontstond. De safener maakte het gebruik van de herbicide Dual Magnum mogelijk als voor-opkomstbehandeling.
Evaluatie van de resistentie tegen doelbladvlekken
Het SCP werd geplant bij het Central Crops Research Station in Clayton, NC op 14-15 juni 2017 en 20 juni 2018 in een gerandomiseerd, compleet blokontwerp met in elk geval twee experimentele replicaties. Experimenten werden geplant in 1,8 m enkele rijen met een rijbreedte van 0,9 m met 10 zaden per plot. Twee randrijen werden rond de periferie van elk experiment geplant om randeffecten te voorkomen. De experimenten werden geïnoculeerd op 20 juli 2017 en 20 juli 2018, waarop de sorghumplanten zich in groeistadium 3 bevonden. Beoordelingen werden genomen op een schaal van één tot negen, waarbij planten die geen tekenen van ziekte vertoonden werden gescoord als een negen en volledig dode planten werden gescoord als een één. Twee beoordelingen werden genomen in 2017 en vier metingen in 2018, beginnend twee weken na inoculatie van elk jaar. sAUDPC (gestandaardiseerd gebied onder de curve van ziekteprogressie) werd berekend zoals eerder beschreven.
Plaatsingstijd: 1 april 2021