De seizoensgebonden neerslagverdeling in de provincie Guizhou is ongelijk, met meer neerslag in de lente en zomer. De koolzaadzaailingen zijn echter gevoelig voor droogtestress in de herfst en winter, wat de opbrengst ernstig beïnvloedt. Mosterd is een bijzonder oliezaadgewas dat voornamelijk in de provincie Guizhou wordt verbouwd. Het heeft een sterke droogtetolerantie en kan in bergachtige gebieden worden geteeld. Het is een rijke bron van droogteresistente genen. De ontdekking van droogteresistente genen is van cruciaal belang voor de verbetering van mosterdvariëteiten en innovatie in de genetische diversiteit. De GRF-familie speelt een cruciale rol in de groei en ontwikkeling van planten en de reactie op droogtestress. Momenteel zijn GRF-genen gevonden in Arabidopsis², rijst (Oryza sativa)¹², koolzaad¹³, katoen (Gossypium hirsutum)¹⁴, tarwe (Triticum aestivum)¹⁵, parelgierst (Setaria italica)¹⁶ en Brassica¹⁷, maar er zijn geen meldingen van GRF-genen in mosterd. In deze studie werden de GRF-familiegenen van mosterd op genoomniveau geïdentificeerd en hun fysieke en chemische kenmerken, evolutionaire verwantschappen, homologie, geconserveerde motieven, genstructuur, genduplicaties, cis-elementen en zaailingstadium (vierbladstadium) geanalyseerd. De expressiepatronen onder droogtestress werden uitgebreid geanalyseerd om een wetenschappelijke basis te bieden voor verder onderzoek naar de potentiële functie van BjGRF-genen in de reactie op droogte en om kandidaatgenen te identificeren voor de veredeling van droogtetolerante mosterd.
In het genoom van Brassica juncea werden 34 BjGRF-genen geïdentificeerd met behulp van twee HMMER-zoekopdrachten. Alle genen bevatten de QLQ- en WRC-domeinen. De CDS-sequenties van de geïdentificeerde BjGRF-genen worden weergegeven in Aanvullende Tabel S1. BjGRF01–BjGRF34 zijn benoemd op basis van hun locatie op het chromosoom. De fysisch-chemische eigenschappen van deze familie wijzen erop dat de lengte van de aminozuren sterk varieert, van 261 aminozuren (BjGRF19) tot 905 aminozuren (BjGRF28). Het iso-elektrisch punt van BjGRF varieert van 6,19 (BjGRF02) tot 9,35 (BjGRF03) met een gemiddelde van 8,33, en 88,24% van BjGRF is een basisch eiwit. Het voorspelde molecuulgewichtbereik van BjGRF ligt tussen 29,82 kDa (BjGRF19) en 102,90 kDa (BjGRF28); de instabiliteitsindex van BjGRF-eiwitten varieert van 51,13 (BjGRF08) tot 78,24 (BjGRF19), alle waarden zijn hoger dan 40, wat aangeeft dat de vetzuurindex varieert van 43,65 (BjGRF01) tot 78,78 (BjGRF22), de gemiddelde hydrofiliteit (GRAVY) varieert van -1,07 (BjGRF31) tot -0,45 (BjGRF22), alle hydrofiele BjGRF-eiwitten hebben negatieve GRAVY-waarden, wat mogelijk te wijten is aan een gebrek aan hydrofobiciteit veroorzaakt door de residuen. Uit de voorspelling van de subcellulaire lokalisatie bleek dat 31 door BjGRF gecodeerde eiwitten in de nucleus gelokaliseerd konden worden, BjGRF04 in peroxisomen, BjGRF25 in het cytoplasma en BjGRF28 in chloroplasten (Tabel 1). Dit duidt erop dat BjGRF's zich mogelijk in de nucleus bevinden en een belangrijke regulerende rol spelen als transcriptiefactor.
Fylogenetische analyse van GRF-families in verschillende soorten kan helpen bij het bestuderen van genfuncties. Daarom werden de volledige aminozuursequenties van 35 koolzaad-, 16 raap-, 12 rijst-, 10 gierst- en 9 Arabidopsis-GRF's gedownload en werd een fylogenetische boom geconstrueerd op basis van 34 geïdentificeerde BjGRF-genen (Fig. 1). De drie subfamilies bevatten verschillende aantallen leden; 116 GRF-transcriptiefactoren zijn verdeeld over drie verschillende subfamilies (groepen A~C), die respectievelijk 59 (50,86%), 34 (29,31%) en 23 (19,83)% van de GRF's bevatten. Van deze 34 BjGRF-familieleden zijn er 34 verspreid over de 3 subfamilies: 13 leden in groep A (38,24%), 12 leden in groep B (35,29%) en 9 leden in groep C (26,47%). Tijdens het polyploïdisatieproces van mosterd varieert het aantal BjGRF-genen in verschillende subfamilies, en kunnen genamplificatie en -verlies hebben plaatsgevonden. Het is opmerkelijk dat er geen GRF's van rijst en gierst voorkomen in groep C, terwijl er 2 GRF's van rijst en 1 GRF van gierst in groep B aanwezig zijn. Bovendien zijn de meeste GRF's van rijst en gierst in één tak gegroepeerd, wat erop wijst dat BjGRF's nauw verwant zijn aan dicotylen. De meest diepgaande studies naar de GRF-functie in Arabidopsis thaliana bieden een basis voor functioneel onderzoek naar BjGRF's.
Fylogenetische stamboom van mosterd, inclusief Brassica napus, rijst, gierst en leden van de Arabidopsis thaliana GRF-familie.
Analyse van repetitieve genen in de GRF-familie van mosterd. De grijze lijn op de achtergrond geeft een gesynchroniseerd blok in het mosterdgenoom weer, de rode lijn geeft een paar gesegmenteerde herhalingen van het BjGRF-gen weer;
De expressie van het BjGRF-gen onder droogtestress in het vierde bladstadium. De qRT-PCR-gegevens zijn weergegeven in aanvullende tabel S5. Significante verschillen in de gegevens worden aangegeven met kleine letters.
Naarmate het wereldwijde klimaat blijft veranderen, is het bestuderen van hoe gewassen omgaan met droogtestress en het verbeteren van hun tolerantiemechanismen een belangrijk onderzoeksonderwerp geworden18. Na een droogteperiode veranderen de morfologische structuur, genexpressie en metabolische processen van planten, wat kan leiden tot het stoppen van de fotosynthese en metabolische verstoringen, met gevolgen voor de opbrengst en kwaliteit van gewassen19,20,21. Wanneer planten droogtesignalen waarnemen, produceren ze secundaire boodschappers zoals Ca2+ en fosfatidylinositol, verhogen ze de intracellulaire calciumionenconcentratie en activeren ze het regulerende netwerk van de eiwitfosforyleringsroute22,23. Het uiteindelijke doelwitproteïne is direct betrokken bij cellulaire afweer of reguleert de expressie van gerelateerde stressgenen via transcriptiefactoren (TF's), waardoor de tolerantie van planten voor stress wordt verhoogd24,25. TF's spelen dus een cruciale rol in de reactie op droogtestress. Op basis van de sequentie en DNA-bindingseigenschappen van droogtestress-responsieve TF's kunnen TF's worden onderverdeeld in verschillende families, zoals GRF, ERF, MYB, WRKY en andere families26.
De GRF-genfamilie is een type plant-specifieke transcriptiefactor (TF) die een belangrijke rol speelt in diverse aspecten zoals groei, ontwikkeling, signaaltransductie en plantenafweerreacties27. Sinds het eerste GRF-gen werd geïdentificeerd in O. sativa28, zijn er steeds meer GRF-genen geïdentificeerd in vele soorten, waarvan is aangetoond dat ze de plantengroei, -ontwikkeling en stressreactie beïnvloeden8, 29, 30,31,32. Met de publicatie van de genoomsequentie van Brassica juncea werd de identificatie van de BjGRF-genfamilie mogelijk33. In deze studie werden 34 BjGRF-genen geïdentificeerd in het gehele mosterdgenoom en benoemd als BjGRF01–BjGRF34 op basis van hun chromosomale positie. Ze bevatten allemaal sterk geconserveerde QLQ- en WRC-domeinen. Analyse van de fysisch-chemische eigenschappen toonde aan dat de verschillen in het aantal aminozuren en het molecuulgewicht van de BjGRF-eiwitten (met uitzondering van BjGRF28) niet significant waren, wat erop wijst dat de leden van de BjGRF-familie mogelijk vergelijkbare functies hebben. Uit de analyse van de genstructuur bleek dat 64,7% van de BjGRF-genen vier exonen bevatte, wat erop wijst dat de genstructuur van BjGRF relatief geconserveerd is in de evolutie. Het aantal exonen in de genen BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 en BjGRF29 is echter groter. Studies hebben aangetoond dat de toevoeging of verwijdering van exonen of intronen kan leiden tot verschillen in genstructuur en -functie, waardoor nieuwe genen ontstaan34,35,36. Daarom veronderstellen we dat het intron van BjGRF tijdens de evolutie verloren is gegaan, wat mogelijk veranderingen in de genfunctie veroorzaakt. In overeenstemming met bestaande studies vonden we ook dat het aantal intronen verband houdt met genexpressie. Wanneer een gen een groot aantal intronen bevat, kan het gen sneller reageren op diverse ongunstige factoren.
Gen duplicatie is een belangrijke factor in de genomische en genetische evolutie37. Verwante studies hebben aangetoond dat gen duplicatie niet alleen het aantal GRF-genen vergroot, maar ook dient als middel om nieuwe genen te genereren die planten helpen zich aan te passen aan diverse ongunstige omgevingsomstandigheden38. In deze studie werden in totaal 48 gedupliceerde genparen gevonden, die allemaal segmentale duplicaties waren. Dit wijst erop dat segmentale duplicaties het belangrijkste mechanisme zijn voor de toename van het aantal genen in deze familie. In de literatuur is gerapporteerd dat segmentale duplicatie de amplificatie van GRF-genfamilieleden in Arabidopsis en aardbei effectief kan bevorderen, en dat er in geen van beide soorten tandemduplicaties van deze genfamilie zijn gevonden27,39. De resultaten van deze studie komen overeen met bestaande studies naar Arabidopsis thaliana en aardbeifamilies, wat suggereert dat de GRF-familie het aantal genen kan vergroten en nieuwe genen kan genereren door middel van segmentale duplicatie in verschillende planten.
In deze studie werden in totaal 34 BjGRF-genen geïdentificeerd in mosterd, die werden onderverdeeld in 3 subfamilies. Deze genen vertoonden vergelijkbare geconserveerde motieven en genstructuren. Collineariteitsanalyse bracht 48 paren segmentduplicaties in mosterd aan het licht. Het BjGRF-promotergebied bevat cis-activerende elementen die geassocieerd zijn met lichtrespons, hormonale respons, respons op omgevingsstress en groei en ontwikkeling. De expressie van de 34 BjGRF-genen werd gedetecteerd in het mosterdzaailingstadium (wortels, stengels, bladeren), en het expressiepatroon van 10 BjGRF-genen onder droogteomstandigheden. Er werd vastgesteld dat de expressiepatronen van BjGRF-genen onder droogtestress vergelijkbaar waren en mogelijk een rol spelen bij de regulatie van droogtestress. De genen BjGRF03 en BjGRF32 spelen mogelijk een positieve regulerende rol bij droogtestress, terwijl BjGRF06 en BjGRF23 een rol spelen als miR396-doelgenen bij droogtestress. Over het geheel genomen biedt ons onderzoek een biologische basis voor toekomstig onderzoek naar de functie van het BjGRF-gen in Brassicaceae-planten.
De mosterdzaden die in dit experiment werden gebruikt, werden geleverd door het Guizhou Oil Seed Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences. De zaden werden in hun geheel geselecteerd en in aarde geplant (substraat: aarde = 3:1). Na het vierbladstadium werden de wortels, stengels en bladeren verzameld. De planten werden behandeld met 20% PEG 6000 om droogte te simuleren, waarna de bladeren na 0, 3, 6, 12 en 24 uur werden verzameld. Alle plantenmonsters werden direct ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens bewaard in een vriezer van -80 °C voor de volgende test.
Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn verkregen of geanalyseerd, zijn opgenomen in het gepubliceerde artikel en de aanvullende informatiebestanden.
Geplaatst op: 22 januari 2025