In deze studie werd de letaliteit, subletaliteit en toxiciteit van commerciële stoffen beoordeeld.cypermethrinformuleringen voor kikkervisjes. In de acute test werden concentraties van 100–800 μg/L gedurende 96 uur getest. In de chronische test werden van nature voorkomende cypermethrinconcentraties (1, 3, 6 en 20 μg/L) getest op sterfte, gevolgd door micronucleustesten en onderzoek naar afwijkingen in de kernen van rode bloedcellen gedurende 7 dagen. De LC50 van de commerciële cypermethrinformulering voor kikkervisjes was 273,41 μg L−1. In de chronische test resulteerde de hoogste concentratie (20 μg L−1) in een sterfte van meer dan 50%, aangezien de helft van de geteste kikkervisjes stierf. De micronucleustest toonde significante resultaten bij 6 en 20 μg L−1 en er werden verschillende afwijkingen in de kernen gedetecteerd, wat aangeeft dat de commerciële cypermethrinformulering genotoxisch potentieel heeft tegen P. gracilis. Cypermethrin vormt een groot risico voor deze soort, wat erop wijst dat het diverse problemen kan veroorzaken en de dynamiek van dit ecosysteem op korte en lange termijn kan beïnvloeden. Hieruit kan worden geconcludeerd dat commerciële cypermethrinpreparaten toxische effecten hebben op P. gracilis.
Door de voortdurende uitbreiding van landbouwactiviteiten en de intensieve toepassing vanongediertebestrijdingDoor de maatregelen worden waterdieren vaak blootgesteld aan pesticiden1,2. Vervuiling van waterbronnen in de buurt van landbouwvelden kan de ontwikkeling en overleving van niet-doelorganismen zoals amfibieën beïnvloeden.
Amfibieën worden steeds belangrijker bij de beoordeling van milieumatrices. Kikkers worden beschouwd als goede bio-indicatoren voor milieuverontreiniging vanwege hun unieke kenmerken, zoals complexe levenscycli, snelle larvale groei, trofische status, doorlaatbare huid10,11, afhankelijkheid van water voor voortplanting12 en onbeschermde eieren11,13,14. De kleine waterkikker (Physalaemus gracilis), algemeen bekend als de wenende kikker, is een bio-indicatorsoort gebleken voor pesticidenverontreiniging4,5,6,7,15. De soort komt voor in stilstaand water, beschermde gebieden of gebieden met een variabel habitat in Argentinië, Uruguay, Paraguay en Brazilië1617 en wordt door de IUCN-classificatie als stabiel beschouwd vanwege zijn brede verspreiding en tolerantie voor verschillende habitats18.
Er zijn subletale effecten gemeld bij amfibieën na blootstelling aan cypermethrin, waaronder gedrags-, morfologische en biochemische veranderingen bij kikkervisjes23,24,25, veranderde sterfte en metamorfosetijd, enzymatische veranderingen, verminderd uitkomstsucces24,25, hyperactiviteit26, remming van de cholinesterase-activiteit27 en veranderingen in zwemvermogen7,28. Studies naar de genotoxische effecten van cypermethrin bij amfibieën zijn echter beperkt. Daarom is het belangrijk om de gevoeligheid van kikkersoorten voor cypermethrin te beoordelen.
Milieuvervuiling beïnvloedt de normale groei en ontwikkeling van amfibieën, maar het ernstigste nadelige effect is genetische schade aan het DNA veroorzaakt door blootstelling aan pesticiden13. Analyse van de morfologie van bloedcellen is een belangrijke bio-indicator voor vervuiling en potentiële toxiciteit van een stof voor wilde soorten29. De micronucleustest is een van de meest gebruikte methoden om de genotoxiciteit van chemicaliën in het milieu te bepalen30. Het is een snelle, effectieve en goedkope methode die een goede indicator is voor chemische vervuiling van organismen zoals amfibieën31,32 en informatie kan verschaffen over blootstelling aan genotoxische verontreinigende stoffen33.
Het doel van deze studie was om het toxische potentieel van commerciële cypermethrinpreparaten voor kleine waterdieren, zoals kikkervisjes, te evalueren met behulp van een micronucleustest en een ecologische risicobeoordeling.
Cumulatieve sterfte (%) van P. gracilis-larven die tijdens de acute fase van de test werden blootgesteld aan verschillende concentraties commerciële cypermethrin.
Cumulatieve sterfte (%) van P. gracilis-larven blootgesteld aan verschillende concentraties commerciële cypermethrin tijdens een chronische test.
De waargenomen hoge sterfte was het gevolg van genotoxische effecten bij amfibieën die werden blootgesteld aan verschillende concentraties cypermethrin (6 en 20 μg/L), zoals blijkt uit de aanwezigheid van micronuclei (MN) en nucleaire afwijkingen in erytrocyten. De vorming van MN duidt op fouten in de mitose en wordt geassocieerd met een slechte binding van chromosomen aan microtubuli, defecten in eiwitcomplexen die verantwoordelijk zijn voor de opname en het transport van chromosomen, fouten in de chromosoomsegregatie en fouten in het herstel van DNA-schade38,39 en kan verband houden met door pesticiden geïnduceerde oxidatieve stress40,41. Andere afwijkingen werden waargenomen bij alle geëvalueerde concentraties. Toenemende cypermethrinconcentraties verhoogden de nucleaire afwijkingen in erytrocyten met respectievelijk 5% en 20% bij de laagste (1 μg/L) en hoogste (20 μg/L) dosis. Veranderingen in het DNA van een soort kunnen bijvoorbeeld ernstige gevolgen hebben voor de overleving op zowel korte als lange termijn, met als gevolg een afname van de populatie, een veranderde reproductieve fitheid, inteelt, verlies van genetische diversiteit en veranderde migratiesnelheden. Al deze factoren kunnen de overleving en het behoud van een soort beïnvloeden42,43. De vorming van erytroïde afwijkingen kan wijzen op een blokkade in de cytokinese, wat resulteert in abnormale celdeling (binucleaire erytrocyten)44,45; meervoudig gelobde kernen zijn uitstulpingen van het kernmembraan met meerdere lobben46, terwijl andere erytroïde afwijkingen geassocieerd kunnen worden met DNA-amplificatie, zoals kernnieren/blebs47. De aanwezigheid van anucleaire erytrocyten kan wijzen op een verstoord zuurstoftransport, vooral in verontreinigd water48,49. Apoptose duidt op celdood50.
Andere studies hebben ook de genotoxische effecten van cypermethrin aangetoond. Kabaña et al.51 toonden de aanwezigheid van micronuclei en veranderingen in de celkern, zoals binucleaire cellen en apoptotische cellen, aan in cellen van Odontophrynus americanus na blootstelling aan hoge concentraties cypermethrin (5000 en 10.000 μg L−1) gedurende 96 uur. Cypermethrin-geïnduceerde apoptose werd ook waargenomen in P. biligonigerus52 en Rhinella arenarum53. Deze resultaten suggereren dat cypermethrin genotoxische effecten heeft op een reeks waterorganismen en dat de MN- en ENA-test een indicator kan zijn voor subletale effecten op amfibieën en toepasbaar kan zijn op inheemse soorten en wilde populaties die aan toxische stoffen worden blootgesteld12.
Commerciële formuleringen van cypermethrin vormen een groot milieugevaar (zowel acuut als chronisch), met HQ-waarden die de norm van het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) overschrijden54 en die schadelijk kunnen zijn voor de soort als ze in het milieu aanwezig zijn. In de chronische risicobeoordeling was de NOEC voor sterfte 3 μg L−1, wat bevestigt dat de in water aangetroffen concentraties een risico kunnen vormen voor de soort55. De letale NOEC voor R. arenarum-larven die werden blootgesteld aan een mengsel van endosulfan en cypermethrin was 500 μg L−1 na 168 uur; deze waarde daalde tot 0,0005 μg L−1 na 336 uur. De auteurs tonen aan dat hoe langer de blootstelling, hoe lager de concentraties die schadelijk zijn voor de soort. Het is ook belangrijk om te benadrukken dat de NOEC-waarden hoger waren dan die van P. gracilis bij dezelfde blootstellingstijd, wat aangeeft dat de reactie van de soort op cypermethrin soortspecifiek is. Bovendien bereikte de CHQ-waarde van P. gracilis na blootstelling aan cypermethrin een sterftecijfer van 64,67, wat hoger is dan de referentiewaarde van het Amerikaanse Environmental Protection Agency54. Ook de CHQ-waarde van R. arenarum-larven was hoger (CHQ > 388,00 na 336 uur), wat erop wijst dat de onderzochte insecticiden een hoog risico vormen voor verschillende amfibiesoorten. Aangezien P. gracilis ongeveer 30 dagen nodig heeft om de metamorfose te voltooien56, kan worden geconcludeerd dat de onderzochte concentraties cypermethrin kunnen bijdragen aan de populatieafname doordat geïnfecteerde individuen niet op jonge leeftijd het volwassen of voortplantingsstadium bereiken.
Bij de berekende risicobeoordeling van micronuclei en andere afwijkingen aan de kernen van rode bloedcellen varieerden de CHQ-waarden van 14,92 tot 97,00, wat aangeeft dat cypermethrin een potentieel genotoxisch risico vormt voor P. gracilis, zelfs in zijn natuurlijke habitat. Rekening houdend met de mortaliteit, was de maximale concentratie van xenobiotische stoffen die P. gracilis verdraagt 4,24 μg L−1. Concentraties zo laag als 1 μg/L vertoonden echter ook genotoxische effecten. Dit kan leiden tot een toename van het aantal afwijkende individuen57 en de ontwikkeling en voortplanting van soorten in hun habitats beïnvloeden, wat kan leiden tot een afname van de amfibieënpopulaties.
Commerciële formuleringen van het insecticide cypermethrin vertoonden een hoge acute en chronische toxiciteit voor P. gracilis. Er werden hogere sterftecijfers waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van toxische effecten, zoals blijkt uit de aanwezigheid van micronuclei en afwijkingen in de kernen van erytrocyten, met name gekartelde kernen, gelobde kernen en vesiculaire kernen. Daarnaast vertoonde de onderzochte soort verhoogde risico's voor het milieu, zowel acuut als chronisch. Deze gegevens, gecombineerd met eerdere studies van onze onderzoeksgroep, toonden aan dat zelfs verschillende commerciële formuleringen van cypermethrin nog steeds een verminderde activiteit van acetylcholinesterase (AChE) en butyrylcholinesterase (BChE) en oxidatieve stress veroorzaakten58, en resulteerden in veranderingen in zwemactiviteit en orale misvormingen59 bij P. gracilis, wat aangeeft dat commerciële formuleringen van cypermethrin een hoge letale en subletale toxiciteit hebben voor deze soort. Hartmann et al. Uit onderzoek 60 bleek dat commerciële formuleringen van cypermethrin het giftigst waren voor P. gracilis en een andere soort van hetzelfde geslacht (P. cuvieri), vergeleken met negen andere pesticiden. Dit suggereert dat wettelijk goedgekeurde concentraties van cypermethrin voor milieubescherming kunnen leiden tot een hoge sterfte en een langdurige afname van de populatie.
Verder onderzoek is nodig om de toxiciteit van het bestrijdingsmiddel voor amfibieën te beoordelen, aangezien de in het milieu aangetroffen concentraties een hoge sterfte kunnen veroorzaken en een potentieel risico vormen voor P. gracilis. Onderzoek naar amfibiesoorten moet worden aangemoedigd, omdat er weinig gegevens over deze organismen beschikbaar zijn, met name over Braziliaanse soorten.
De chronische toxiciteitstest duurde 168 uur (7 dagen) onder statische omstandigheden en de subletale concentraties waren: 1, 3, 6 en 20 μg actieve stof L−1. In beide experimenten werden 10 kikkervisjes per behandelingsgroep geëvalueerd met zes herhalingen, voor een totaal van 60 kikkervisjes per concentratie. De behandeling met alleen water diende als negatieve controle. Elke experimentele opstelling bestond uit een steriele glazen schaal met een inhoud van 500 ml en een dichtheid van 1 kikkervisje per 50 ml oplossing. De schaal werd afgedekt met polyethyleenfolie om verdamping te voorkomen en werd continu belucht.
Het water werd chemisch geanalyseerd om de pesticideconcentraties te bepalen na 0, 96 en 168 uur. Volgens Sabin et al. 68 en Martins et al. 69 werden de analyses uitgevoerd in het Pesticide Analysis Laboratory (LARP) van de Federale Universiteit van Santa Maria met behulp van gaschromatografie gekoppeld aan drievoudige quadrupoolmassaspectrometrie (Varian model 1200, Palo Alto, Californië, VS). De kwantitatieve bepaling van pesticiden in water is weergegeven als aanvullend materiaal (Tabel SM1).
Voor de micronucleustest (MNT) en de test op afwijkingen in de kernen van rode bloedcellen (RNA) werden 15 kikkervisjes uit elke behandelingsgroep geanalyseerd. De kikkervisjes werden verdoofd met 5% lidocaïne (50 mg g-170) en bloedmonsters werden afgenomen door middel van een hartpunctie met behulp van wegwerpspuiten met heparine. Bloeduitstrijkjes werden gemaakt op steriele microscoopglaasjes, aan de lucht gedroogd, gefixeerd met 100% methanol (4 °C) gedurende 2 minuten en vervolgens gekleurd met een 10% Giemsa-oplossing gedurende 15 minuten in het donker. Na afloop van het proces werden de glaasjes gewassen met gedestilleerd water om overtollige kleurstof te verwijderen en gedroogd bij kamertemperatuur.
Van elke kikkervis werden minstens 1000 rode bloedcellen (RBC's) geanalyseerd met een 100× microscoop met een 71x objectief om de aanwezigheid van MN en ENA te bepalen. In totaal werden 75.796 RBC's van kikkervisjes geëvalueerd, rekening houdend met de cypermethrinconcentraties en de controles. Genotoxiciteit werd geanalyseerd volgens de methode van Carrasco et al. en Fenech et al.38,72 door de frequentie van de volgende kernlaesies te bepalen: (1) anucleaire cellen: cellen zonder kern; (2) apoptotische cellen: kernfragmentatie, geprogrammeerde celdood; (3) binucleaire cellen: cellen met twee kernen; (4) kernuitstulpingen of blaasjescellen: cellen met kernen met kleine uitstulpingen van het kernmembraan, blaasjes vergelijkbaar in grootte met micronuclei; (5) gekaryolyseerde cellen: cellen met alleen de omtrek van de kern zonder inwendig materiaal; (6) gekerfde cellen: cellen met kernen die duidelijke scheuren of inkepingen in hun vorm vertonen, ook wel niervormige kernen genoemd; (7) gelobde cellen: cellen met kernuitstulpingen die groter zijn dan de eerdergenoemde blaasjes; en (8) microcellen: cellen met gecondenseerde kernen en gereduceerd cytoplasma. De veranderingen werden vergeleken met de resultaten van de negatieve controle.
De resultaten van de acute toxiciteitstest (LC50) werden geanalyseerd met behulp van GBasic-software en de TSK-Trimmed Spearman-Karber-methode74. De gegevens van de chronische test werden vooraf gecontroleerd op normaliteit van de fouten (Shapiro-Wilks) en homogeniteit van de variantie (Bartlett). De resultaten werden geanalyseerd met behulp van een eenwegsvariantieanalyse (ANOVA). De Tukey-test werd gebruikt om de gegevens onderling te vergelijken, en de Dunnett-test werd gebruikt om de gegevens tussen de behandelingsgroep en de negatieve controlegroep te vergelijken.
De LOEC- en NOEC-gegevens werden geanalyseerd met behulp van de Dunnett-test. Statistische tests werden uitgevoerd met Statistica 8.0-software (StatSoft) met een significantieniveau van 95% (p < 0,05).
Geplaatst op: 13 maart 2025