In deze studie werd de dodelijkheid, subdodelijkheid en toxiciteit van commerciëlecypermethrineformuleringen aan kikkervisjes. In de acute test werden concentraties van 100–800 μg/l gedurende 96 uur getest. In de chronische test werden natuurlijk voorkomende cypermethrineconcentraties (1, 3, 6 en 20 μg/l) getest op mortaliteit, gevolgd door micronucleustesten en nucleaire afwijkingen in rode bloedcellen gedurende 7 dagen. De LC50 van de commerciële cypermethrineformulering aan kikkervisjes was 273,41 μg L−1. In de chronische test resulteerde de hoogste concentratie (20 μg L−1) in meer dan 50% mortaliteit, aangezien het de helft van de geteste kikkervisjes doodde. De micronucleustest toonde significante resultaten bij 6 en 20 μg L−1 en er werden verschillende nucleaire afwijkingen gedetecteerd, wat aangeeft dat de commerciële cypermethrineformulering genotoxisch potentieel heeft tegen P. gracilis. Cypermethrine vormt een hoog risico voor deze soort, wat aangeeft dat het meerdere problemen kan veroorzaken en de dynamiek van dit ecosysteem op korte en lange termijn kan beïnvloeden. Daarom kan worden geconcludeerd dat commerciële cypermethrineformuleringen toxische effecten hebben op P. gracilis.
Door de voortdurende uitbreiding van de landbouwactiviteiten en de intensieve toepassing vanongediertebestrijdingDoor de maatregelen worden waterdieren vaak blootgesteld aan pesticiden1,2. Verontreiniging van waterbronnen in de buurt van landbouwgronden kan de ontwikkeling en overleving van niet-doelorganismen zoals amfibieën beïnvloeden.
Amfibieën worden steeds belangrijker bij de beoordeling van milieumatrices. Amfibieën worden beschouwd als goede bio-indicatoren voor milieuverontreinigende stoffen vanwege hun unieke kenmerken, zoals complexe levenscycli, snelle groei van larven, trofische status, doorlaatbare huid10,11, afhankelijkheid van water voor voortplanting12 en onbeschermde eieren11,13,14. De kleine waterkikker (Physalaemus gracilis), beter bekend als de treurkikker, is een bio-indicatorsoort voor pesticidevervuiling4,5,6,7,15. De soort wordt aangetroffen in stilstaande wateren, beschermde gebieden of gebieden met een wisselende habitat in Argentinië, Uruguay, Paraguay en Brazilië1617 en wordt door de IUCN-classificatie als stabiel beschouwd vanwege zijn brede verspreiding en tolerantie voor verschillende habitats18.
Er zijn subletale effecten gemeld bij amfibieën na blootstelling aan cypermethrine, waaronder gedrags-, morfologische en biochemische veranderingen bij kikkervisjes23,24,25, een afwijkende mortaliteit en metamorfosetijd, enzymatische veranderingen, een verminderd uitkomstsucces24,25, hyperactiviteit26, remming van de cholinesteraseactiviteit27 en veranderingen in zwemprestaties7,28. Er is echter beperkt onderzoek gedaan naar de genotoxische effecten van cypermethrine bij amfibieën. Daarom is het belangrijk om de gevoeligheid van anura-soorten voor cypermethrine te beoordelen.
Milieuvervuiling beïnvloedt de normale groei en ontwikkeling van amfibieën, maar de ernstigste nadelige gevolgen zijn genetische DNA-schade veroorzaakt door blootstelling aan pesticiden13. Analyse van de morfologie van bloedcellen is een belangrijke bio-indicator voor vervuiling en de potentiële toxiciteit van een stof voor wilde soorten29. De micronucleustest is een van de meest gebruikte methoden om de genotoxiciteit van chemicaliën in het milieu te bepalen30. Het is een snelle, effectieve en goedkope methode die een goede indicator is voor chemische vervuiling van organismen zoals amfibieën31,32 en informatie kan verschaffen over blootstelling aan genotoxische stoffen33.
Het doel van deze studie was om het toxische potentieel van commerciële cypermethrinformuleringen voor kleine waterkikkervisjes te evalueren met behulp van een micronucleustest en een ecologische risicobeoordeling.
Cumulatieve mortaliteit (%) van P. gracilis-kikkervisjes die tijdens de acute periode van de test aan verschillende concentraties commercieel cypermethrine werden blootgesteld.
Cumulatieve mortaliteit (%) van P. gracilis-kikkervisjes die tijdens een chronische test aan verschillende concentraties commerciële cypermethrine werden blootgesteld.
De waargenomen hoge mortaliteit was het gevolg van genotoxische effecten bij amfibieën die werden blootgesteld aan verschillende concentraties cypermethrine (6 en 20 μg/l), zoals blijkt uit de aanwezigheid van micronuclei (MN) en nucleaire afwijkingen in erytrocyten. De vorming van MN wijst op fouten in de mitose en wordt geassocieerd met een slechte binding van chromosomen aan microtubuli, defecten in eiwitcomplexen die verantwoordelijk zijn voor de opname en het transport van chromosomen, fouten in de chromosoomsegregatie en fouten in het herstel van DNA-schade38,39 en kan verband houden met door pesticiden geïnduceerde oxidatieve stress40,41. Andere afwijkingen werden waargenomen bij alle geëvalueerde concentraties. Toenemende cypermethrineconcentraties verhoogden de nucleaire afwijkingen in erytrocyten met respectievelijk 5% en 20% bij de laagste (1 μg/l) en hoogste (20 μg/l) doses. Veranderingen in het DNA van een soort kunnen bijvoorbeeld ernstige gevolgen hebben voor de overleving op zowel de korte als de lange termijn, met als gevolg populatieafname, verminderde reproductieve fitheid, inteelt, verlies van genetische diversiteit en veranderde migratiesnelheden. Al deze factoren kunnen van invloed zijn op de overleving en het behoud van soorten42,43. De vorming van erytroïde afwijkingen kan wijzen op een blokkade van de cytokinese, wat resulteert in abnormale celdeling (binucleaire erytrocyten)44,45; meerlobbige kernen zijn uitsteeksels van het kernmembraan met meerdere lobben46, terwijl andere erytroïde afwijkingen, zoals kernnieren/blebs47, geassocieerd kunnen zijn met DNA-amplificatie. De aanwezigheid van kernloze erytrocyten kan wijzen op een verminderd zuurstoftransport, vooral in vervuild water48,49. Apoptose duidt op celdood50.
Andere studies hebben ook de genotoxische effecten van cypermethrine aangetoond. Kabaña et al.51 toonden de aanwezigheid aan van micronuclei en nucleaire veranderingen, zoals binucleaire cellen en apoptotische cellen, in Odontophrynus americanus-cellen na blootstelling aan hoge concentraties cypermethrine (5000 en 10.000 μg L−1) gedurende 96 uur. Cypermethrine-geïnduceerde apoptose werd ook gedetecteerd in P. biligonigerus52 en Rhinella arenarum53. Deze resultaten suggereren dat cypermethrine genotoxische effecten heeft op een reeks waterorganismen en dat de MN- en ENA-test een indicator kan zijn van subletale effecten op amfibieën en mogelijk toepasbaar is op inheemse soorten en wilde populaties die zijn blootgesteld aan toxische stoffen12.
Commerciële formuleringen van cypermethrin vormen een groot gevaar voor het milieu (zowel acuut als chronisch), met HQ's die het niveau van het Amerikaanse Environmental Protection Agency (EPA) overschrijden54 en die de soort schadelijk kunnen beïnvloeden als ze in het milieu aanwezig zijn. In de chronische risicobeoordeling was de NOEC voor mortaliteit 3 μg L−1, wat bevestigt dat de concentraties die in water worden aangetroffen een risico voor de soort kunnen vormen55. De letale NOEC voor R. arenarum-larven die werden blootgesteld aan een mengsel van endosulfan en cypermethrin was 500 μg L−1 na 168 uur; deze waarde daalde tot 0,0005 μg L−1 na 336 uur. De auteurs tonen aan dat hoe langer de blootstelling, hoe lager de concentraties die schadelijk zijn voor de soort. Het is ook belangrijk om te benadrukken dat de NOEC-waarden hoger waren dan die van P. gracilis bij dezelfde blootstellingstijd, wat aangeeft dat de soortrespons op cypermethrin soortspecifiek is. Bovendien bereikte de CHQ-waarde van P. gracilis na blootstelling aan cypermethrine een mortaliteit van 64,67, wat hoger is dan de referentiewaarde van het Amerikaanse Environmental Protection Agency54, en ook de CHQ-waarde van R. arenarum-larven was hoger dan deze waarde (CHQ > 388,00 na 336 uur), wat aangeeft dat de bestudeerde insecticiden een hoog risico vormen voor verschillende amfibiesoorten. Aangezien P. gracilis ongeveer 30 dagen nodig heeft om de metamorfose te voltooien56, kan worden geconcludeerd dat de bestudeerde concentraties cypermethrine mogelijk bijdragen aan de populatieafname door te voorkomen dat geïnfecteerde exemplaren op jonge leeftijd de volwassen of reproductieve fase bereiken.
In de berekende risicobeoordeling van micronuclei en andere afwijkingen in de kern van erytrocyten varieerden de CHQ-waarden van 14,92 tot 97,00, wat erop wijst dat cypermethrine een potentieel genotoxisch risico vormde voor P. gracilis, zelfs in zijn natuurlijke habitat. Rekening houdend met de mortaliteit, was de maximale concentratie xenobiotische stoffen die P. gracilis kon verdragen 4,24 μg L−1. Concentraties van slechts 1 μg/L vertoonden echter ook genotoxische effecten. Dit feit kan leiden tot een toename van het aantal afwijkende individuen57 en de ontwikkeling en voortplanting van soorten in hun habitat beïnvloeden, wat leidt tot een afname van de amfibieënpopulaties.
Commerciële formuleringen van het insecticide cypermethrin vertoonden een hoge acute en chronische toxiciteit voor P. gracilis. Er werden hogere sterftecijfers waargenomen, waarschijnlijk als gevolg van toxische effecten, zoals blijkt uit de aanwezigheid van micronuclei en afwijkingen in de kern van erytrocyten, met name gekartelde kernen, gelobde kernen en vesiculaire kernen. Bovendien vertoonden de bestudeerde soorten verhoogde milieurisico's, zowel acuut als chronisch. Deze gegevens, gecombineerd met eerdere studies door onze onderzoeksgroep, toonden aan dat zelfs verschillende commerciële formuleringen van cypermethrin nog steeds een verminderde acetylcholinesterase (AChE) en butyrylcholinesterase (BChE) activiteit en oxidatieve stress veroorzaakten58, en resulteerden in veranderingen in zwemactiviteit en orale misvormingen59 bij P. gracilis, wat aangeeft dat commerciële formuleringen van cypermethrin een hoge letale en subletale toxiciteit hebben voor deze soort. Hartmann et al. Uit 60 onderzoeken bleek dat commerciële formuleringen van cypermethrine het meest giftig waren voor P. gracilis en een andere soort van hetzelfde geslacht (P. cuvieri), vergeleken met negen andere pesticiden. Dit suggereert dat wettelijk goedgekeurde concentraties cypermethrine voor milieubescherming kunnen leiden tot een hoge sterfte en een langdurige afname van de populatie.
Verder onderzoek is nodig om de toxiciteit van het pesticide voor amfibieën te beoordelen, aangezien de concentraties in het milieu een hoge sterfte kunnen veroorzaken en een potentieel risico vormen voor P. gracilis. Onderzoek naar amfibiesoorten moet worden aangemoedigd, aangezien gegevens over deze organismen schaars zijn, met name over Braziliaanse soorten.
De chronische toxiciteitstest duurde 168 uur (7 dagen) onder statische omstandigheden en de subletale concentraties waren: 1, 3, 6 en 20 μg ai L−1. In beide experimenten werden 10 kikkervisjes per behandelingsgroep geëvalueerd met zes replicaties, wat neerkomt op een totaal van 60 kikkervisjes per concentratie. De behandeling met alleen water diende als negatieve controle. Elke experimentele opstelling bestond uit een steriele glazen schaal met een inhoud van 500 ml en een dichtheid van 1 kikkervisje per 50 ml oplossing. De kolf was afgedekt met polyethyleenfolie om verdamping te voorkomen en werd continu belucht.
Het water werd chemisch geanalyseerd om de pesticideconcentraties te bepalen op 0, 96 en 168 uur. Volgens Sabin et al. 68 en Martins et al. 69 werden de analyses uitgevoerd in het Pesticide Analysis Laboratory (LARP) van de Federale Universiteit van Santa Maria met behulp van gaschromatografie gekoppeld aan triple-quadrupoolmassaspectrometrie (Varian model 1200, Palo Alto, Californië, VS). De kwantitatieve bepaling van pesticiden in water wordt weergegeven als aanvullend materiaal (tabel SM1).
Voor de micronucleustest (MNT) en de test op nucleaire afwijkingen in rode bloedcellen (RNA) werden 15 kikkervisjes uit elke behandelgroep geanalyseerd. De kikkervisjes werden verdoofd met 5% lidocaïne (50 mg g-170) en bloedmonsters werden afgenomen door middel van hartpunctie met behulp van wegwerpspuiten met heparine. Bloeduitstrijkjes werden bereid op steriele microscoopglaasjes, aan de lucht gedroogd, gedurende 2 minuten gefixeerd met 100% methanol (4 °C) en vervolgens gedurende 15 minuten in het donker gekleurd met 10% Giemsa-oplossing. Aan het einde van het proces werden de glaasjes gewassen met gedestilleerd water om overtollige kleurstof te verwijderen en bij kamertemperatuur gedroogd.
Ten minste 1000 RBC's van elk kikkervisje werden geanalyseerd met behulp van een 100× microscoop met een 71 objectief om de aanwezigheid van MN en ENA te bepalen. In totaal werden 75.796 RBC's van kikkervisjes geëvalueerd rekening houdend met cypermethrineconcentraties en controles. Genotoxiciteit werd geanalyseerd volgens de methode van Carrasco et al. en Fenech et al.38,72 door de frequentie van de volgende nucleaire laesies te bepalen: (1) anucleaire cellen: cellen zonder kern; (2) apoptotische cellen: nucleaire fragmentatie, geprogrammeerde celdood; (3) binucleaire cellen: cellen met twee kernen; (4) nucleaire knoppen of blebcellen: cellen met kernen met kleine uitsteeksels van het kernmembraan, blebs vergelijkbaar in grootte met micronuclei; (5) gekaryolyseerde cellen: cellen met alleen de omtrek van de kern zonder intern materiaal; (6) gekerfde cellen: cellen met kernen met duidelijke scheuren of inkepingen in hun vorm, ook wel niervormige kernen genoemd; (7) gelobde cellen: cellen met kernuitsteeksels die groter zijn dan de bovengenoemde vesikels; en (8) microcellen: cellen met gecondenseerde kernen en gereduceerd cytoplasma. De veranderingen werden vergeleken met de resultaten van de negatieve controle.
De resultaten van de acute toxiciteitstest (LC50) werden geanalyseerd met behulp van GBasic-software en de TSK-Trimmed Spearman-Karber-methode74. De chronische testgegevens werden vooraf getest op foutnormaliteit (Shapiro-Wilks) en homogeniteit van variantie (Bartlett). De resultaten werden geanalyseerd met behulp van een enkelvoudige variantieanalyse (ANOVA). De Tukey-toets werd gebruikt om de gegevens onderling te vergelijken en de Dunnett-toets om de gegevens van de behandelgroep en de negatieve controlegroep te vergelijken.
LOEC- en NOEC-gegevens werden geanalyseerd met de Dunnett-toets. Statistische toetsen werden uitgevoerd met Statistica 8.0-software (StatSoft) met een significantieniveau van 95% (p < 0,05).
Plaatsingstijd: 13-03-2025