DELLA-eiwitten zijn geconserveerde master-eiwitten.groeiregulatorendie een centrale rol spelen in de regulatie van de plantenontwikkeling als reactie op interne en omgevingssignalen. DELLA fungeert als transcriptieregulator en wordt gerekruteerd naar doelpromotors door binding aan transcriptiefactoren (TF's) en histone H2A via zijn GRAS-domein. Recente studies hebben aangetoond dat de stabiliteit van DELLA posttranslationeel wordt gereguleerd via twee mechanismen: polyubiquitinering geïnduceerd door het fytohormoon gibberelline, wat leidt tot snelle afbraak, en conjugatie van kleine ubiquitine-achtige modificatoren (SUMO) om de accumulatie ervan te verhogen. Daarnaast wordt de activiteit van DELLA dynamisch gereguleerd door twee verschillende glycosyleringen: de DELLA-TF-interactie wordt versterkt door O-fucosylering, maar geremd door O-gekoppelde N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)-modificatie. De rol van DELLA-fosforylering blijft echter onduidelijk, aangezien eerdere studies tegenstrijdige resultaten hebben laten zien, variërend van studies die aantonen dat fosforylering de afbraak van DELLA bevordert of juist remt, tot studies die aantonen dat fosforylering de stabiliteit ervan niet beïnvloedt. Hier identificeren we fosforyleringsplaatsen in REPRESSOR.ga1-3(RGA, AtDELLA) gezuiverd uit Arabidopsis thaliana door middel van massaspectrometrie-analyse en laten zien dat fosforylering van twee RGA-peptiden in de PolyS- en PolyS/T-regio's de binding van H2A bevordert en de RGA-activiteit verhoogt. Associatie van RGA met doelpromotors. Opvallend is dat fosforylering geen invloed heeft op de interacties tussen RGA en TF of op de stabiliteit van RGA. Onze studie onthult het moleculaire mechanisme waarmee fosforylering de DELLA-activiteit induceert.
Om de rol van fosforylering bij de regulatie van DELLA-functie op te helderen, is het cruciaal om DELLA-fosforyleringsplaatsen in vivo te identificeren en functionele analyses in planten uit te voeren. Door middel van affiniteitszuivering van plantenextracten, gevolgd door MS/MS-analyse, hebben we verschillende fosforyleringsplaatsen in RGA geïdentificeerd. Onder omstandigheden van GA-tekort neemt de fosforylering van RHA toe, maar fosforylering heeft geen invloed op de stabiliteit ervan. Belangrijk is dat co-IP- en ChIP-qPCR-assays aantoonden dat fosforylering in het PolyS/T-gebied van RGA de interactie met H2A en de associatie met doelpromotoren bevordert, waarmee het mechanisme wordt onthuld waarmee fosforylering de RGA-functie induceert.
RGA wordt gerekruteerd naar doelchromatine via de interactie van het LHR1-subdomein met TF en bindt vervolgens aan H2A via het PolyS/T-gebied en het PFYRE-subdomein, waardoor het H2A-RGA-TF-complex wordt gevormd om RGA te stabiliseren. Fosforylering van Pep 2 in het PolyS/T-gebied tussen het DELLA-domein en het GRAS-domein door een onbekende kinase versterkt de binding tussen RGA en H2A. Het rgam2A-mutantproteïne heft de fosforylering van RGA op en neemt een andere proteïneconformatie aan om de binding met H2A te verstoren. Dit resulteert in destabilisatie van de tijdelijke TF-rgam2A-interacties en de dissociatie van rgam2A van doelchromatine. Deze afbeelding toont alleen de door RGA gemedieerde transcriptieonderdrukking. Een soortgelijk patroon kan worden beschreven voor RGA-gemedieerde transcriptionele activering, met dien verstande dat het H2A-RGA-TF-complex de transcriptie van doelgenen zou bevorderen en defosforylering van rgam2A de transcriptie zou verminderen. Figuur aangepast van Huang et al.21.
Alle kwantitatieve gegevens werden statistisch geanalyseerd met Excel, en significante verschillen werden vastgesteld met behulp van de t-toets van Student. Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen. Er werden geen gegevens uitgesloten van de analyse; het experiment was niet gerandomiseerd; de onderzoekers waren niet blind voor de verdeling van de gegevens tijdens het experiment en de evaluatie van de resultaten. De steekproefomvang is aangegeven in het figuuronderschrift en het brongegevensbestand.
Voor meer informatie over het onderzoeksontwerp, zie de samenvatting van het Natural Portfolio Report die bij dit artikel hoort.
Massaspectrometrie-proteomicsgegevens zijn via de PRIDE66-partnerrepository met dataset-identificatiecode PXD046004 aan het ProteomeXchange-consortium bijgedragen. Alle overige gegevens die tijdens dit onderzoek zijn verkregen, worden gepresenteerd in de aanvullende informatie, aanvullende gegevensbestanden en ruwe gegevensbestanden. Brongegevens voor dit artikel zijn beschikbaar.
Geplaatst op: 8 november 2024