DELLA-eiwitten zijn geconserveerde meestersgroeiregulatorendie een centrale rol spelen in de regulatie van de plantenontwikkeling als reactie op interne en omgevingsfactoren. DELLA fungeert als een transcriptionele regulator en wordt aangestuurd door doelpromotoren door binding aan transcriptiefactoren (TF's) en histon H2A via zijn GRAS-domein. Recente studies hebben aangetoond dat de stabiliteit van DELLA posttranslationeel wordt gereguleerd via twee mechanismen: polyubiquitinatie geïnduceerd door het fytohormoon gibberelline, wat leidt tot snelle afbraak, en conjugatie van kleine ubiquitine-achtige modificatoren (SUMO) om de accumulatie te verhogen. Daarnaast wordt de activiteit van DELLA dynamisch gereguleerd door twee verschillende glycosyleringen: de DELLA-TF-interactie wordt versterkt door O-fucosylering, maar geremd door O-gelinkte N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) modificatie. De rol van DELLA-fosforylering blijft echter onduidelijk, aangezien eerdere studies tegenstrijdige resultaten lieten zien, variërend van studies die aantonen dat fosforylering de afbraak van DELLA bevordert of vermindert tot studies die aantonen dat fosforylering de stabiliteit ervan niet beïnvloedt. Hier identificeren we fosforyleringslocaties in REPRESSORga1-3(RGA, AtDELLA) gezuiverd uit Arabidopsis thaliana door middel van massaspectrometrie-analyse en tonen aan dat fosforylering van twee RGA-peptiden in de PolyS- en PolyS/T-regio's H2A-binding en verhoogde RGA-activiteit bevordert. Associatie van RGA met doelpromotoren. Opvallend is dat fosforylering geen invloed heeft op RGA-TF-interacties of RGA-stabiliteit. Onze studie onthult het moleculaire mechanisme waarmee fosforylering DELLA-activiteit induceert.
Om de rol van fosforylering bij de regulering van de DELLA-functie te verduidelijken, is het cruciaal om DELLA-fosforyleringsplaatsen in vivo te identificeren en functionele analyses in planten uit te voeren. Door affiniteitszuivering van plantenextracten, gevolgd door MS/MS-analyse, identificeerden we verschillende fosfosites in RGA. Onder omstandigheden van GA-deficiëntie neemt de fosforylering van RHA toe, maar fosforylering heeft geen invloed op de stabiliteit. Belangrijk is dat co-IP- en ChIP-qPCR-tests aantoonden dat fosforylering in de PolyS/T-regio van RGA de interactie met H2A en de associatie met doelpromotoren bevordert, wat het mechanisme onthult waarmee fosforylering de RGA-functie induceert.
RGA wordt aangetrokken door targetchromatine via de interactie van het LHR1-subdomein met TF en bindt vervolgens aan H2A via het PolyS/T-gebied en PFYRE-subdomein, waardoor het H2A-RGA-TF-complex wordt gevormd om RGA te stabiliseren. Fosforylering van Pep 2 in het PolyS/T-gebied tussen het DELLA-domein en het GRAS-domein door een niet-geïdentificeerde kinase versterkt de binding van RGA aan H2A. Het mutante rgam2A-eiwit heft de fosforylering van RGA op en neemt een andere eiwitconformatie aan om de binding van H2A te verstoren. Dit resulteert in destabilisatie van tijdelijke TF-rgam2A-interacties en dissociatie van rgam2A van targetchromatine. Deze afbeelding toont alleen RGA-gemedieerde transcriptionele repressie. Een vergelijkbaar patroon kon worden beschreven voor RGA-gemedieerde transcriptionele activatie, met dien verstande dat het H2A-RGA-TF-complex de transcriptie van het doelgen zou bevorderen en defosforylering van rgam2A de transcriptie zou verminderen. Figuur aangepast van Huang et al.21.
Alle kwantitatieve gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van Excel en significante verschillen werden bepaald met de t-toets van Student. Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang voorlopig te bepalen. Er werden geen gegevens uitgesloten van de analyse; het experiment was niet gerandomiseerd; de onderzoekers waren niet blind voor de dataverdeling tijdens het experiment en de evaluatie van de resultaten. De steekproefomvang wordt aangegeven in de legenda van de figuur en het bronbestand.
Voor meer informatie over het onderzoeksontwerp, zie de samenvatting van het Natural Portfolio Report dat bij dit artikel hoort.
Massaspectrometrie-proteomicsgegevens zijn via de PRIDE66-partnerrepository aan het ProteomeXchange-consortium bijgedragen met dataset-id PXD046004. Alle overige tijdens deze studie verkregen gegevens worden gepresenteerd in de Aanvullende Informatie, Aanvullende Databestanden en Ruwe Databestanden. Brongegevens worden voor dit artikel verstrekt.
Plaatsingstijd: 8 november 2024