DELLA-eiwitten zijn geconserveerd.groeiregulatorendie een centrale rol spelen in de plantenontwikkeling als reactie op interne en externe signalen. Als transcriptieregulatoren binden DELLA's zich via hun GRAS-domeinen aan transcriptiefactoren (TF's) en histone H2A en worden ze gerekruteerd om in te werken op promotors. Recente studies hebben aangetoond dat de stabiliteit van DELLA post-translationeel wordt gereguleerd door twee mechanismen: polyubiquitinering geïnduceerd door het plantenhormoongibberellineDit leidt tot hun snelle afbraak en conjugatie met kleine ubiquitine-achtige modifiers (SUMO), wat hun accumulatie verhoogt. Bovendien wordt de activiteit van DELLA dynamisch gereguleerd door twee verschillende glycosyleringsmechanismen: O-fucosylering versterkt de DELLA-TF-interactie, terwijl O-gekoppelde N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)-modificatie de DELLA-TF-interactie remt. De rol van DELLA-fosforylering is echter onduidelijk, aangezien eerdere studies tegenstrijdige resultaten hebben laten zien. Sommige studies suggereren dat fosforylering de afbraak van DELLA bevordert of remt, terwijl andere suggereren dat fosforylering geen invloed heeft op hun stabiliteit. Hier identificeren we fosforyleringsplaatsen in de GA1-3-repressor (RGA), AtDELLA, gezuiverd uit Arabidopsis thaliana door middel van massaspectrometrie en tonen we aan dat fosforylering van twee RGA-peptiden in de PolyS- en PolyS/T-regio's de RGA-activiteit versterkt door de binding van H2A en de associatie van RGA met doelpromotors te bevorderen. Opvallend is dat fosforylering geen invloed had op de interacties tussen RGA en TF of op de stabiliteit van RGA. Onze studie onthult een moleculair mechanisme waarmee fosforylering de activiteit van DELLA induceert.
Onze massaspectrometrische analyse toonde aan dat zowel Pep1 als Pep2 sterk gefosforyleerd waren in RGA in de GA-deficiënte Ga1-achtergrond. Naast deze studie hebben fosfoproteomische studies ook fosforylering van Pep1 in RGA aangetoond, hoewel de rol ervan nog niet is onderzocht53,54,55. Fosforylering van Pep2 is daarentegen nog niet eerder beschreven, aangezien dit peptide alleen kon worden gedetecteerd met behulp van het RGAGKG-transgeen. Hoewel de m1A-mutatie, die de fosforylering van Pep1 opheft, de RGA-activiteit in planten slechts licht verminderde, had deze een additief effect in combinatie met m2A op de vermindering van de RGA-activiteit (Aanvullende figuur 6). Belangrijk is dat de fosforylering van Pep1 significant verminderd was in de GA-versterkte sly1-mutant vergeleken met ga1, wat suggereert dat GA de defosforylering van RGA bevordert en daarmee de activiteit ervan vermindert. Het mechanisme waarmee GA de fosforylering van RGA onderdrukt, vereist verder onderzoek. Een mogelijke verklaring is dat dit bereikt wordt door de regulatie van een niet-geïdentificeerde proteïnekinase. Hoewel studies hebben aangetoond dat de expressie van de CK1-proteïnekinase EL1 door GA in rijst wordt geremd41, wijzen onze resultaten erop dat mutaties van hogere orde van het Arabidopsis EL1-homoloog (AEL1-4) de RGA-fosforylering niet verminderen. In overeenstemming met onze resultaten heeft een recent fosfoproteomisch onderzoek met Arabidopsis AEL-overexpressielijnen en een ael-triplemutant geen DELLA-eiwitten als substraten van deze kinases geïdentificeerd56. Toen we het manuscript voorbereidden, werd gerapporteerd dat GSK3, het gen dat codeert voor een GSK3/SHAGGY-achtige kinase in tarwe (Triticum aestivum), DELLA (Rht-B1b) kan fosforyleren57, hoewel fosforylering van Rht-B1b door GSK3 niet in planten is bevestigd. Enzymatische reacties in vitro in aanwezigheid van GSK3, gevolgd door massaspectrometrie-analyse, brachten drie fosforyleringsplaatsen aan het licht tussen de DELLA- en GRAS-domeinen van Rht-B1b (aanvullende figuur 3). Substituties van serine naar alanine op alle drie de fosforyleringsplaatsen resulteerden in een verminderde Rht-B1b-activiteit in transgene tarwe, wat overeenkomt met onze bevindingen dat alanine-substituties in Pep2 RGA de RGA-activiteit verlaagden. In vitro eiwitafbraaktesten toonden echter verder aan dat fosforylering Rht-B1b57 ook kan stabiliseren. Dit staat in contrast met onze resultaten die aantonen dat alanine-substituties in Pep2 RGA de stabiliteit ervan in planten niet veranderen. GSK3 in tarwe is een ortholoog van brassinosteroïde-ongevoelig eiwit 2 (BIN2) in Arabidopsis 57. BIN2 is een negatieve regulator van BR-signalering, en BR activeert de signaleringsroute door BIN2-afbraak te veroorzaken 58. We hebben aangetoond dat BR-behandeling de RGA-stabiliteit 59 of de fosforyleringsniveaus in Arabidopsis niet verlaagt (aanvullende figuur 2), wat suggereert dat RGA waarschijnlijk niet door BIN2 wordt gefosforyleerd.
Alle kwantitatieve gegevens werden statistisch geanalyseerd met Excel, en significante verschillen werden vastgesteld met behulp van de t-toets van Student. Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefomvang vooraf te bepalen. Er werden geen gegevens uitgesloten van de analyse; het experiment was niet gerandomiseerd; en de onderzoekers waren tijdens het experiment en de beoordeling van de uitkomsten op de hoogte van de toewijzing. De steekproefgroottes worden vermeld in de figuren en in de ruwe databestanden.
Geplaatst op: 15 april 2025