DELLA-eiwitten zijn geconserveerdgroeiregulatorendie een centrale rol spelen in de ontwikkeling van planten als reactie op interne en externe signalen. Als transcriptionele regulatoren binden DELLA's zich aan transcriptiefactoren (TF's) en histon H2A via hun GRAS-domeinen en worden ze aangestuurd om op promotors in te werken. Recente studies hebben aangetoond dat de stabiliteit van DELLA's posttranslationeel wordt gereguleerd door twee mechanismen: polyubiquitinatie geïnduceerd door het plantenhormoongibberelline, wat leidt tot hun snelle afbraak, en conjugatie met een kleine ubiquitine-achtige modifier (SUMO), wat hun accumulatie verhoogt. Bovendien wordt DELLA-activiteit dynamisch gereguleerd door twee verschillende glycosyleringsmechanismen: O-fucosylering versterkt de DELLA-TF-interactie, terwijl O-gekoppelde N-acetylglucosamine (O-GlcNAc)-modificatie de DELLA-TF-interactie remt. De rol van DELLA-fosforylering is echter onduidelijk, aangezien eerdere studies tegenstrijdige resultaten hebben laten zien. Sommige suggereren dat fosforylering de afbraak van DELLA bevordert of onderdrukt, terwijl andere suggereren dat fosforylering hun stabiliteit niet beïnvloedt. Hier identificeren we fosforyleringsplaatsen in de GA1-3-repressor (RGA), AtDELLA, gezuiverd uit Arabidopsis thaliana met behulp van massaspectrometrie, en laten we zien dat fosforylering van twee RGA-peptiden in de PolyS- en PolyS/T-regio's de RGA-activiteit versterkt door H2A-binding en RGA-associatie met doelpromotoren te bevorderen. Opvallend is dat fosforylering geen invloed had op de interacties tussen RGA en TF of de stabiliteit van RGA. Onze studie onthult een moleculair mechanisme waarmee fosforylering DELLA-activiteit induceert.
Onze massaspectrometrische analyse toonde aan dat zowel Pep1 als Pep2 sterk gefosforyleerd waren in RGA in de GA-deficiënte Ga1-achtergrond. Naast deze studie hebben fosfoproteomische studies ook Pep1-fosforylering in RGA onthuld, hoewel de rol ervan nog niet is onderzocht53,54,55. Daarentegen is Pep2-fosforylering nog niet eerder beschreven, aangezien dit peptide alleen kon worden gedetecteerd met behulp van het RGAGKG-transgen. Hoewel de m1A-mutatie, die de Pep1-fosforylering tenietdeed, de RGA-activiteit in planten slechts licht verminderde, had deze een additief effect in combinatie met m2A bij het verminderen van de RGA-activiteit (aanvullende figuur 6). Belangrijk is dat de Pep1-fosforylering significant verminderd was in de GA-versterkte sly1-mutant in vergelijking met ga1, wat suggereert dat GA de defosforylering van RGA bevordert en de activiteit ervan vermindert. Het mechanisme waarmee GA de RGA-fosforylering onderdrukt, moet verder worden onderzocht. Een mogelijkheid is dat dit wordt bereikt door de regulatie van een ongeïdentificeerde proteïnekinase. Hoewel studies hebben aangetoond dat de expressie van de CK1-proteïnekinase EL1 wordt onderdrukt door GA in rijst41, wijzen onze resultaten erop dat hogere-orde mutaties van de Arabidopsis EL1-homoloog (AEL1-4) de RGA-fosforylering niet verminderen. In overeenstemming met onze resultaten identificeerde een recente fosfoproteomische studie met Arabidopsis AEL-overexpressielijnen en een ael-triple-mutant geen DELLA-eiwitten als substraten van deze kinases56. Toen we het manuscript opstelden, werd gerapporteerd dat GSK3, het gen dat codeert voor een GSK3/SHAGGY-achtige kinase in tarwe (Triticum aestivum), DELLA (Rht-B1b)57 kan fosforyleren, hoewel fosforylering van Rht-B1b door GSK3 in planten niet is bevestigd. In vitro enzymatische reacties in aanwezigheid van GSK3, gevolgd door massaspectrometrieanalyse, onthulden drie fosforyleringsplaatsen gelegen tussen de DELLA- en GRAS-domeinen van Rht-B1b (aanvullende figuur 3). Serine-naar-alaninesubstituties op alle drie de fosforyleringsplaatsen resulteerden in een verminderde Rht-B1b-activiteit in transgene tarwe, wat consistent is met onze bevindingen dat alaninesubstituties in Pep2 RGA de RGA-activiteit verminderden. In vitro eiwitafbraakanalyses toonden echter verder aan dat fosforylering Rht-B1b57 ook kan stabiliseren. Dit staat in contrast met onze resultaten die aantonen dat alaninesubstituties in Pep2 RGA de stabiliteit ervan in planten niet veranderen. GSK3 in tarwe is een ortholoog van brassinosteroid-insensitive protein 2 (BIN2) in Arabidopsis 57. BIN2 is een negatieve regulator van BR-signalering en BR activeert zijn signaleringspad door BIN2-afbraak te veroorzaken 58. Wij hebben aangetoond dat behandeling met BR de stabiliteit van RGA 59 of de fosforyleringsniveaus in Arabidopsis niet vermindert (aanvullende figuur 2), wat suggereert dat het onwaarschijnlijk is dat RGA door BIN2 wordt gefosforyleerd.
Alle kwantitatieve gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van Excel en significante verschillen werden bepaald met de Student's t-toets. Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefgrootte vooraf te bepalen. Er werden geen gegevens uitgesloten van de analyse; het experiment was niet gerandomiseerd; en de onderzoekers waren op de hoogte van de toewijzing tijdens het experiment en de uitkomstbeoordeling. Steekproefgroottes worden weergegeven in de legenda van de figuren en in de bestanden met onbewerkte gegevens.
Plaatsingstijd: 15-04-2025