De groei van het apicale scheutmeristeem (SAM) is cruciaal voor de stengelstructuur. PlantenhormonengibberellinenGibberellinen (GA's) spelen een cruciale rol in de coördinatie van plantengroei, maar hun rol in het stengelapicale meridianen (SAM) is nog steeds onduidelijk. Hier hebben we een ratiometrische biosensor voor GA-signalering ontwikkeld door het DELLA-eiwit zodanig te modificeren dat de essentiële regulerende functie ervan in de GA-transcriptierespons wordt onderdrukt, terwijl de afbraak ervan na GA-herkenning behouden blijft. We tonen aan dat deze op afbraak gebaseerde biosensor nauwkeurig veranderingen in GA-niveaus en cellulaire detectie tijdens de ontwikkeling registreert. We hebben deze biosensor gebruikt om de GA-signaleringsactiviteit in het SAM in kaart te brengen. We laten zien dat hoge GA-signalen voornamelijk aanwezig zijn in cellen tussen orgaanprimordia, de voorlopers van internodiumcellen. Met behulp van gain-of-function- en loss-of-function-benaderingen tonen we verder aan dat GA de oriëntatie van het celdelingsvlak reguleert, de canonieke cellulaire organisatie van internodiumcellen vaststelt en zo de internodiumspecificatie in het SAM bevordert.
Het apicale stengelmeristeem (SAM), gelegen aan de top van de stengel, bevat een niche van stamcellen waarvan de activiteit op modulaire en iteratieve wijze gedurende het hele leven van de plant laterale organen en stengelknopen genereert. Elk van deze herhalende eenheden, of plantenknopen, omvat internodiën en laterale organen bij de knopen, en okselmeristemen in de bladoksels¹. De groei en organisatie van plantenknopen verandert tijdens de ontwikkeling. Bij Arabidopsis wordt de groei van internodiën onderdrukt tijdens het vegetatieve stadium en blijven de okselmeristemen inactief in de oksels van de rozetbladeren. Tijdens de overgang naar de bloeifase wordt het SAM het bloeiwijzemeristeem, dat verlengde internodiën en okselknoppen, vertakkingen in de oksels van de stengelbladeren en later bladloze bloemen genereert². Hoewel we aanzienlijke vooruitgang hebben geboekt in het begrijpen van de mechanismen die de aanleg van bladeren, bloemen en takken reguleren, is er relatief weinig bekend over hoe internodiën ontstaan.
Inzicht in de spatiotemporele distributie van GA's zal bijdragen aan een beter begrip van de functies van deze hormonen in verschillende weefsels en ontwikkelingsstadia. Visualisatie van de afbraak van RGA-GFP-fusie, tot expressie gebracht onder invloed van de eigen promotor, levert belangrijke informatie op over de regulatie van de totale GA-niveaus in wortels15,16. De expressie van RGA varieert echter tussen weefsels17 en wordt gereguleerd door GA18. Differentiële expressie van de RGA-promotor kan dus leiden tot het fluorescentiepatroon dat wordt waargenomen met RGA-GFP, waardoor deze methode niet kwantitatief is. Recentelijk heeft bioactief fluoresceïne (Fl)-gelabeld GA19,20 de accumulatie van GA in de wortelcortex en de regulatie van de cellulaire niveaus ervan door GA-transport aangetoond. Recentelijk heeft de GA FRET-sensor nlsGPS1 aangetoond dat GA-niveaus correleren met celverlenging in wortels, filamenten en in het donker gekweekte hypocotylen21. Zoals we echter hebben gezien, is de GA-concentratie niet de enige parameter die de GA-signaleringsactiviteit reguleert, aangezien deze afhankelijk is van complexe detectieprocessen. Voortbouwend op ons begrip van de DELLA- en GA-signaleringsroutes, beschrijven we hier de ontwikkeling en karakterisering van een op degradatie gebaseerde ratiometrische biosensor voor GA-signalering. Om deze kwantitatieve biosensor te ontwikkelen, gebruikten we een mutante GA-gevoelige RGA die gefuseerd was met een fluorescerend eiwit en ubiquitair tot expressie werd gebracht in weefsels, evenals een GA-ongevoelig fluorescerend eiwit. We tonen aan dat de mutante RGA-eiwitfusies de endogene GA-signalering niet verstoren wanneer ze ubiquitair tot expressie worden gebracht, en dat deze biosensor de signaleringsactiviteit, voortkomend uit zowel GA-input als GA-signaalverwerking door het detectieapparaat, met een hoge spatiotemporele resolutie kan kwantificeren. We gebruikten deze biosensor om de spatiotemporele distributie van GA-signaleringsactiviteit in kaart te brengen en te kwantificeren hoe GA het cellulaire gedrag in de SAM-epidermis reguleert. We tonen aan dat GA de oriëntatie van het delingsvlak van SAM-cellen reguleert, gelegen tussen orgaanprimordia, en daarmee de canonieke cellulaire organisatie van het internodium definieert.
Ten slotte vroegen we ons af of qmRGA veranderingen in endogene GA-niveaus kon registreren met behulp van groeiende hypocotylen. We hebben eerder aangetoond dat nitraat de groei stimuleert door de GA-synthese en daarmee de afbraak van DELLA34 te verhogen. Dienovereenkomstig observeerden we dat de hypocotyllengte van pUBQ10::qmRGA-zaailingen die onder een overvloedige nitraattoevoer (10 mM NO3−) werden gekweekt, significant langer was dan die van zaailingen die onder nitraatdeficiënte omstandigheden werden gekweekt (Aanvullende figuur 6a). In overeenstemming met de groeireactie waren de GA-signalen hoger in de hypocotylen van zaailingen die onder 10 mM NO3−-omstandigheden werden gekweekt dan in zaailingen die in afwezigheid van nitraat werden gekweekt (Aanvullende figuur 6b, c). qmRGA maakt het dus ook mogelijk om veranderingen in GA-signalering te monitoren die worden veroorzaakt door endogene veranderingen in de GA-concentratie.
Om te begrijpen of de door qmRGA gedetecteerde GA-signaleringsactiviteit afhankelijk is van de GA-concentratie en GA-perceptie, zoals verwacht op basis van het sensorontwerp, analyseerden we de expressie van de drie GID1-receptoren in vegetatieve en reproductieve weefsels. In zaailingen toonde de GID1-GUS-reporterlijn aan dat GID1a en c sterk tot expressie kwamen in de zaadlobben (Fig. 3a–c). Bovendien kwamen alle drie de receptoren tot expressie in bladeren, laterale wortelprimordia, worteltoppen (behalve de wortelmuts van GID1b) en het vaatstelsel (Fig. 3a–c). In het SAM van de bloeiwijze detecteerden we alleen GUS-signalen voor GID1b en 1c (Aanvullende Fig. 7a–c). In situ hybridisatie bevestigde deze expressiepatronen en toonde verder aan dat GID1c uniform tot expressie kwam op een laag niveau in het SAM, terwijl GID1b een hogere expressie vertoonde aan de periferie van het SAM (Aanvullende Fig. 7d–l). De pGID1b::2xmTQ2-GID1b translationele fusie onthulde ook een gegradeerd bereik van GID1b-expressie, van lage of geen expressie in het centrum van het SAM tot hoge expressie aan de orgaanranden (Aanvullende Fig. 7m). GID1-receptoren zijn dus niet uniform verdeeld over en binnen weefsels. In daaropvolgende experimenten observeerden we ook dat overexpressie van GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) de gevoeligheid van qmRGA in hypocotylen voor externe GA-toepassing verhoogde (Fig. 3d, e). Daarentegen was de fluorescentie gemeten door qd17mRGA in de hypocotyl ongevoelig voor GA3-behandeling (Fig. 3f, g). Voor beide assays werden zaailingen behandeld met hoge concentraties GA (100 μM GA3) om het snelle gedrag van de sensor te beoordelen, waarbij het vermogen om aan de GID1-receptor te binden werd versterkt of verloren ging. Deze resultaten bevestigen gezamenlijk dat de qmRGA-biosensor een gecombineerde functie vervult als GA- en GA-sensor, en suggereren dat differentiële expressie van de GID1-receptor de emissiviteit van de sensor aanzienlijk kan moduleren.
Tot op heden is de verspreiding van GA-signalen in het SAM nog onduidelijk. Daarom hebben we qmRGA-expresserende planten en de pCLV3::mCherry-NLS-stamcelreporter35 gebruikt om kwantitatieve kaarten met hoge resolutie van de GA-signaleringsactiviteit te berekenen, met de focus op de L1-laag (epidermis; Fig. 4a, b, zie Methoden en Aanvullende Methoden), aangezien L1 een sleutelrol speelt in de controle van de SAM-groei36. De expressie van pCLV3::mCherry-NLS bood hier een vast geometrisch referentiepunt voor het analyseren van de spatiotemporele verspreiding van de GA-signaleringsactiviteit37. Hoewel GA als essentieel wordt beschouwd voor de ontwikkeling van laterale organen4, observeerden we dat de GA-signalen laag waren in het bloemprimordium (P) vanaf het P3-stadium (Fig. 4a, b), terwijl jonge P1- en P2-primordia een matige activiteit vertoonden, vergelijkbaar met die in het centrale gebied (Fig. 4a, b). Een hogere GA-signaleringsactiviteit werd gedetecteerd bij de grenzen van de orgaanprimordia, beginnend bij P1/P2 (aan de zijkanten van de grens) en piekend bij P4, evenals in alle cellen van het perifere gebied tussen de primordia (Fig. 4a, b en Aanvullende Fig. 8a, b). Deze hogere GA-signaleringsactiviteit werd niet alleen waargenomen in de epidermis, maar ook in de L2- en bovenste L3-lagen (Aanvullende Fig. 8b). Het patroon van GA-signalen dat in het SAM werd gedetecteerd met behulp van qmRGA bleef ook onveranderd in de tijd (Aanvullende Fig. 8c–f, k). Hoewel het qd17mRGA-construct systematisch werd gedownreguleerd in het SAM van T3-planten uit vijf onafhankelijke lijnen die we gedetailleerd hebben gekarakteriseerd, konden we de fluorescentiepatronen analyseren die werden verkregen met het pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-construct (Aanvullende Fig. 8g–j, l). In deze controlelijn werden slechts kleine veranderingen in de fluorescentieverhouding in het SAM gedetecteerd, maar in het centrum van het SAM zagen we een duidelijke en onverwachte afname van VENUS geassocieerd met TagBFP. Dit bevestigt dat het door qmRGA waargenomen signaalpatroon de GA-afhankelijke afbraak van mRGA-VENUS weerspiegelt, maar toont ook aan dat qmRGA de GA-signaalactiviteit in het meristeemcentrum mogelijk overschat. Samenvattend onthullen onze resultaten een GA-signaalpatroon dat voornamelijk de verdeling van primordia weerspiegelt. Deze verdeling van het interprimordiale gebied (IPR) is te danken aan de geleidelijke opbouw van een hoge GA-signaalactiviteit tussen het zich ontwikkelende primordium en het centrale gebied, terwijl tegelijkertijd de GA-signaalactiviteit in het primordium afneemt (Fig. 4c, d).
De distributie van GID1b- en GID1c-receptoren (zie hierboven) suggereert dat differentiële expressie van GA-receptoren bijdraagt aan het vormgeven van het patroon van GA-signaleringsactiviteit in het SAM. We vroegen ons af of differentiële accumulatie van GA hierbij een rol zou kunnen spelen. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, gebruikten we de nlsGPS1 GA FRET-sensor21. Een verhoogde activeringsfrequentie werd gedetecteerd in het SAM van nlsGPS1 behandeld met 10 μM GA4+7 gedurende 100 min (Aanvullende figuur 9a–e), wat aangeeft dat nlsGPS1 reageert op veranderingen in de GA-concentratie in het SAM, net zoals in wortels21. De ruimtelijke verdeling van de activeringsfrequentie van nlsGPS1 onthulde relatief lage GA-niveaus in de buitenste lagen van het SAM, maar toonde aan dat deze verhoogd waren in het centrum en aan de randen van het SAM (Figuur 4e en Aanvullende figuur 9a,c). Dit suggereert dat GA ook in het SAM verdeeld is met een ruimtelijk patroon dat vergelijkbaar is met dat onthuld door qmRGA. Als aanvullende benadering behandelden we het SAM ook met fluorescerend GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) of alleen Fl als negatieve controle. Het Fl-signaal was verdeeld over het gehele SAM, inclusief het centrale gebied en het primordium, zij het met een lagere intensiteit (Fig. 4j en Aanvullende Fig. 10d). Daarentegen accumuleerden alle drie de GA-Fl specifiek binnen de grenzen van het primordium en in wisselende mate in de rest van de IPR, waarbij GA7-Fl accumuleerde in het grootste domein van de IPR (Fig. 4k en Aanvullende Fig. 10a,b). Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit liet zien dat de verhouding tussen de intensiteit in de IPR en daarbuiten hoger was in met GA-Fl behandeld SAM vergeleken met met Fl behandeld SAM (Fig. 4l en Aanvullende Fig. 10c). Samen suggereren deze resultaten dat GA in hogere concentraties aanwezig is in IPR-cellen die zich het dichtst bij de orgaangrens bevinden. Dit suggereert dat het patroon van SAM GA-signaleringsactiviteit het gevolg is van zowel differentiële expressie van GA-receptoren als differentiële accumulatie van GA in IPR-cellen nabij orgaangrenzen. Onze analyse bracht dus een onverwacht spatiotemporeel patroon van GA-signalering aan het licht, met lagere activiteit in het centrum en de primordium van de SAM en hogere activiteit in de IPR in het perifere gebied.
Om de rol van differentiële GA-signaleringsactiviteit in het SAM te begrijpen, analyseerden we de correlatie tussen GA-signaleringsactiviteit, celgroei en celdeling met behulp van realtime time-lapse-beeldvorming van het SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Gezien de rol van GA in groeiregulatie werd een positieve correlatie met parameters voor celgroei verwacht. Daarom vergeleken we eerst de kaarten van GA-signaleringsactiviteit met kaarten van de groeisnelheid van het celoppervlak (als maatstaf voor de mate van celgroei voor een bepaalde cel en voor dochtercellen bij deling) en met kaarten van groei-anisotropie, die de directionaliteit van celgroei meet (ook hier gebruikt voor een bepaalde cel en voor dochtercellen bij deling; Fig. 5a,b, zie Methoden en Aanvullende Methoden). Onze kaarten van de groeisnelheid van het SAM-celoppervlak komen overeen met eerdere waarnemingen38,39, met minimale groeisnelheden aan de rand en maximale groeisnelheden in zich ontwikkelende bloemen (Fig. 5a). Hoofdcomponentenanalyse (PCA) toonde aan dat de GA-signaleringsactiviteit negatief gecorreleerd was met de groeisnelheid aan het celoppervlak (Figuur 5c). We lieten ook zien dat de belangrijkste variatieassen, waaronder de GA-signaleringsinput en de groeisnelheid, orthogonaal waren ten opzichte van de richting bepaald door de hoge CLV3-expressie, wat de uitsluiting van cellen uit het SAM-centrum in de resterende analyses bevestigde. Spearman-correlatieanalyse bevestigde de PCA-resultaten (Figuur 5d), wat aangeeft dat hogere GA-signalen in de IPR niet resulteerden in een grotere celgroei. Correlatieanalyse onthulde echter een lichte positieve correlatie tussen GA-signaleringsactiviteit en groei-anisotropie (Figuur 5c, d), wat suggereert dat hogere GA-signalering in de IPR de richting van de celgroei en mogelijk de positie van het celdelingsvlak beïnvloedt.
a, b Hittekaarten van de gemiddelde oppervlaktegroei (a) en groei-anisotropie (b) in SAM, gemiddeld over zeven onafhankelijke planten (gebruikt als proxies voor respectievelijk de sterkte en richting van celgroei). c PCA-analyse omvatte de volgende variabelen: GA-signaal, oppervlaktegroeiintensiteit, oppervlaktegroei-anisotropie en CLV3-expressie. PCA-component 1 was voornamelijk negatief gecorreleerd met oppervlaktegroeiintensiteit en positief gecorreleerd met het GA-signaal. PCA-component 2 was voornamelijk positief gecorreleerd met oppervlaktegroei-anisotropie en negatief gecorreleerd met CLV3-expressie. De percentages geven de door elke component verklaarde variatie weer. d Spearman-correlatieanalyse tussen GA-signaal, oppervlaktegroeiintensiteit en oppervlaktegroei-anisotropie op weefselniveau, exclusief CZ. Het getal rechts is de Spearman rho-waarde tussen twee variabelen. Sterretjes geven gevallen aan waarin de correlatie/negatieve correlatie zeer significant is. e 3D-visualisatie van Col-0 SAM L1-cellen door middel van confocale microscopie. Nieuwe celwanden die in het SAM (maar niet in het primordium) na 10 uur zijn gevormd, zijn gekleurd op basis van hun hoekwaarden. De kleurenbalk is weergegeven in de rechterbenedenhoek. De inzet toont de corresponderende 3D-afbeelding na 0 uur. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. f Boxplots tonen de celdelingssnelheden in IPR en niet-IPR Col-0 SAM (n = 10 onafhankelijke planten). De middenlijn geeft de mediaan weer en de boxgrenzen geven het 25e en 75e percentiel aan. De snorharen geven de minimum- en maximumwaarden weer, bepaald met R-software. P-waarden werden verkregen met de tweezijdige t-toets van Welch. g, h Schematisch diagram dat laat zien (g) hoe de hoek van de nieuwe celwand (magenta) ten opzichte van de radiale richting vanuit het centrum van het SAM (witte stippellijn) wordt gemeten (alleen scherpe hoekwaarden, d.w.z. 0-90°, worden in aanmerking genomen), en (h) de omtreks-/laterale en radiale richtingen binnen het meristeem. i Frequentiehistogrammen van de oriëntatie van het celdelingsvlak over respectievelijk het SAM (donkerblauw), IPR (middelblauw) en niet-IPR (lichtblauw). De p-waarden werden verkregen met een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-toets. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. j Frequentiehistogrammen van de oriëntatie van het celdelingsvlak van de IPR rond respectievelijk P3 (lichtgroen), P4 (middelgroen) en P5 (donkergroen). De p-waarden werden verkregen met een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-toets. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.
Vervolgens onderzochten we de correlatie tussen GA-signalering en celdelingsactiviteit door tijdens de test de nieuw gevormde celwanden te identificeren (Fig. 5e). Deze aanpak stelde ons in staat de frequentie en richting van de celdeling te meten. Verrassend genoeg bleek de frequentie van celdelingen in de IPR en de rest van de SAM (niet-IPR, Fig. 5f) vergelijkbaar te zijn, wat erop wijst dat verschillen in GA-signalering tussen IPR- en niet-IPR-cellen de celdeling niet significant beïnvloeden. Dit, en de positieve correlatie tussen GA-signalering en groei-anisotropie, bracht ons ertoe te onderzoeken of de GA-signaleringsactiviteit de oriëntatie van het celdelingsvlak zou kunnen beïnvloeden. We maten de oriëntatie van de nieuwe celwand als een scherpe hoek ten opzichte van de radiale as die het meristeemcentrum en het centrum van de nieuwe celwand verbindt (Fig. 5e-i) en observeerden een duidelijke tendens dat cellen zich delen onder hoeken dicht bij 90° ten opzichte van de radiale as, met de hoogste frequenties waargenomen bij 70-80° (23,28%) en 80-90° (22,62%) (Fig. 5e,i), overeenkomend met celdelingen in de omtreks-/dwarsrichting (Fig. 5h). Om de bijdrage van GA-signalering aan dit celdelingsgedrag te onderzoeken, analyseerden we de celdelingsparameters in de IPR en niet-IPR afzonderlijk (Fig. 5i). We observeerden dat de verdeling van de delingshoek in IPR-cellen verschilde van die in niet-IPR-cellen of in cellen in het gehele SAM, waarbij IPR-cellen een hoger percentage laterale/circulaire celdelingen vertoonden, namelijk 70–80° en 80–90° (respectievelijk 33,86% en 30,71%) (Fig. 5i). Onze observaties onthulden dus een verband tussen hoge GA-signalering en een oriëntatie van het celdelingsvlak die dicht bij de omtreksrichting ligt, vergelijkbaar met de correlatie tussen GA-signaleringsactiviteit en groei-anisotropie (Fig. 5c, d). Om de ruimtelijke instandhouding van dit verband verder te bevestigen, maten we de oriëntatie van het delingsvlak in IPR-cellen rondom het primordium vanaf P3, aangezien de hoogste GA-signaleringsactiviteit in dit gebied werd gedetecteerd vanaf P4 (Fig. 4). De delingshoeken van de IPR rond P3 en P4 vertoonden geen statistisch significante verschillen, hoewel een verhoogde frequentie van laterale celdelingen werd waargenomen in de IPR rond P4 (Fig. 5j). In de IPR-cellen rond P5 werd het verschil in de oriëntatie van het celdelingsvlak echter statistisch significant, met een scherpe toename in de frequentie van transversale celdelingen (Fig. 5j). Samen suggereren deze resultaten dat GA-signalering de oriëntatie van celdelingen in het SAM kan reguleren, wat consistent is met eerdere rapporten40,41 dat hoge GA-signalering een laterale oriëntatie van celdelingen in de IPR kan induceren.
Er wordt voorspeld dat cellen in de IPR niet in primordia zullen worden opgenomen, maar eerder in internodes2,42,43. De transversale oriëntatie van celdelingen in de IPR kan resulteren in de typische organisatie van parallelle longitudinale rijen epidermale cellen in internodes. Onze hierboven beschreven observaties suggereren dat GA-signalering waarschijnlijk een rol speelt in dit proces door de richting van de celdeling te reguleren.
Het verlies van functie van verschillende DELLA-genen resulteert in een constitutieve GA-respons, en della-mutanten kunnen worden gebruikt om deze hypothese te testen44. We analyseerden eerst de expressiepatronen van vijf DELLA-genen in het SAM. Transcriptiefusie van de GUS-lijn45 onthulde dat GAI, RGA, RGL1 en RGL2 (in veel mindere mate) tot expressie kwamen in het SAM (Aanvullende figuur 11a–d). In situ hybridisatie toonde verder aan dat GAI-mRNA zich specifiek ophoopt in primordia en zich ontwikkelende bloemen (Aanvullende figuur 11e). RGL1- en RGL3-mRNA werden gedetecteerd in het gehele SAM-bladerdak en in oudere bloemen, terwijl RGL2-mRNA overvloediger aanwezig was in het grensgebied (Aanvullende figuur 11f–h). Confocale beeldvorming van pRGL3::RGL3-GFP SAM bevestigde de expressie die werd waargenomen door in situ hybridisatie en toonde aan dat RGL3-eiwit zich ophoopt in het centrale deel van het SAM (Aanvullende figuur 11i). Met behulp van de pRGA::GFP-RGA-lijn vonden we ook dat RGA-eiwit zich ophoopt in het SAM, maar dat de hoeveelheid ervan afneemt aan de rand vanaf P4 (Aanvullende figuur 11j). Opvallend is dat de expressiepatronen van RGL3 en RGA consistent zijn met een hogere GA-signaleringsactiviteit in de IPR, zoals gedetecteerd door qmRGA (Figuur 4). Bovendien geven deze gegevens aan dat alle DELLA's tot expressie komen in het SAM en dat hun expressie gezamenlijk het gehele SAM omvat.
Vervolgens analyseerden we de parameters van de celdeling in het wildtype SAM (Ler, controle) en de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (globale) mutanten (Fig. 6a, b). Interessant genoeg observeerden we een statistisch significante verschuiving in de verdeling van de frequenties van de celdelingshoeken in het della globale mutant SAM vergeleken met het wildtype (Fig. 6c). Deze verandering in de della globale mutant was te wijten aan een toename van de frequentie van hoeken van 80-90° (34,71% versus 24,55%) en, in mindere mate, van hoeken van 70-80° (23,78% versus 20,18%), oftewel overeenkomend met transversale celdelingen (Fig. 6c). De frequentie van niet-transversale delingen (0-60°) was ook lager in de della globale mutant (Fig. 6c). De frequentie van transversale celdelingen was significant verhoogd in het SAM van de della global mutant (Fig. 6b). De frequentie van transversale celdelingen in het IPR was ook hoger in de della global mutant vergeleken met het wildtype (Fig. 6d). Buiten het IPR-gebied had het wildtype een meer uniforme verdeling van de celdelingshoeken, terwijl de della global mutant de voorkeur gaf aan tangentiële delingen zoals in het IPR (Fig. 6e). We hebben ook de oriëntatie van celdelingen gekwantificeerd in het SAM van ga2 oxidase (ga2ox) vijfvoudige mutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 en ga2ox6-2), een GA-inactieve mutantachtergrond waarin GA zich ophoopt. In overeenstemming met de toename van GA-niveaus was het SAM van de bloeiwijze van de quintuple ga2ox-mutant groter dan dat van Col-0 (Aanvullende figuur 12a, b), en vergeleken met Col-0 vertoonde het quintuple ga2ox SAM een duidelijk andere verdeling van celdelingshoeken, waarbij de hoekfrequentie toenam van 50° tot 90°, wat wederom tangentiële delingen bevoordeelt (Aanvullende figuur 12a-c). We tonen hiermee aan dat constitutieve activering van GA-signalering en GA-accumulatie laterale celdelingen induceren in de IPR en de rest van het SAM.
a, b 3D-visualisatie van de L1-laag van PI-gekleurde Ler (a) en globale della-mutant (b) SAM met behulp van confocale microscopie. Nieuwe celwanden die in de SAM (maar niet in het primordium) gedurende een periode van 10 uur zijn gevormd, worden weergegeven en gekleurd op basis van hun hoekwaarden. De inset toont de SAM op 0 uur. De kleurenbalk wordt weergegeven in de rechterbenedenhoek. De pijl in (b) wijst naar een voorbeeld van uitgelijnde celrijen in de globale della-mutant. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. ce Vergelijking van de frequentieverdeling van de oriëntaties van het celdelingsvlak in de gehele SAM (d), IPR (e) en niet-IPR (f) tussen Ler en globale della. P-waarden werden verkregen met behulp van een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisatie van confocale beelden van PI-gekleurde SAM van Col-0 (i) en pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planten. De panelen (a, b) tonen nieuwe celwanden (maar geen primordia) die binnen 10 uur in het SAM zijn gevormd. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. h–j Vergelijking van de frequentieverdeling van de oriëntaties van het celdelingsvlak in het gehele SAM (h), IPR (i) en niet-IPR (j) tussen Col-0 en pCUC2::gai-1-VENUS planten. P-waarden werden verkregen met behulp van een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-test.
Vervolgens testten we het effect van het specifiek remmen van GA-signalering in de IPR. Hiervoor gebruikten we de cotyledon cup 2 (CUC2)-promotor om de expressie aan te sturen van een dominant negatief gai-1-eiwit, gefuseerd aan VENUS (in de pCUC2::gai-1-VENUS-lijn). In het wildtype SAM stuurt de CUC2-promotor de expressie aan van de meeste IPR's in het SAM, inclusief grenscellen, vanaf P4, en een vergelijkbare specifieke expressie werd waargenomen in pCUC2::gai-1-VENUS-planten (zie hieronder). De verdeling van de celdelingshoeken over het SAM of de IPR van pCUC2::gai-1-VENUS-planten verschilde niet significant van die van het wildtype, hoewel we onverwacht ontdekten dat cellen zonder IPR in deze planten met een hogere frequentie van 80-90° deelden (Fig. 6f-j).
Er is gesuggereerd dat de richting van de celdeling afhangt van de geometrie van het SAM, in het bijzonder van de trekspanning die wordt gegenereerd door de weefselkromming46. We hebben daarom onderzocht of de vorm van het SAM veranderd was in de della global mutant en pCUC2::gai-1-VENUS planten. Zoals eerder gerapporteerd12, was de grootte van het SAM van de della global mutant groter dan die van het wildtype (Aanvullende figuur 13a, b, d). In situ hybridisatie van CLV3 en STM RNA bevestigde de meristeemuitbreiding in della mutanten en toonde verder de laterale uitbreiding van de stamcelniche aan (Aanvullende figuur 13e, f, h, i). De kromming van het SAM was echter vergelijkbaar in beide genotypen (Aanvullende figuur 13k, m, n, p). We observeerden een vergelijkbare toename in grootte in de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della viervoudige mutant zonder verandering in kromming in vergelijking met het wildtype (Aanvullende figuur 13c, d, g, j, l, o, p). De frequentie van de celdelingsoriëntatie werd ook beïnvloed in de della viervoudige mutant, maar in mindere mate dan in de della monolithische mutant (Aanvullende figuur 12d-f). Dit dosisafhankelijke effect, samen met het ontbreken van een effect op de kromming, suggereert dat residuele RGL3-activiteit in de Della viervoudige mutant veranderingen in de celdelingsoriëntatie als gevolg van verlies van DELLA-activiteit beperkt en dat veranderingen in laterale celdelingen optreden als reactie op veranderingen in GA-signaleringsactiviteit in plaats van veranderingen in SAM-geometrie. Zoals hierboven beschreven, stuurt de CUC2-promotor de IPR-expressie in het SAM aan vanaf P4 (Aanvullende figuur 14a, b), en daarentegen had het pCUC2::gai-1-VENUS SAM een kleinere omvang maar een hogere kromming (Aanvullende figuur 14c-h). Deze verandering in de morfologie van het pCUC2::gai-1-VENUS SAM kan resulteren in een andere verdeling van mechanische spanningen vergeleken met het wildtype, waarbij hoge omtrekspanningen op een kortere afstand van het SAM-centrum beginnen47. Alternatief kunnen de veranderingen in de morfologie van het pCUC2::gai-1-VENUS SAM het gevolg zijn van veranderingen in regionale mechanische eigenschappen die worden geïnduceerd door transgene expressie48. In beide gevallen zou dit de effecten van veranderingen in GA-signalering gedeeltelijk kunnen compenseren door de kans te vergroten dat cellen zich in de omtreks-/transversale richting delen, wat onze waarnemingen verklaart.
Samengevat bevestigen onze gegevens dat een hogere GA-signalering een actieve rol speelt in de laterale oriëntatie van het celdelingsvlak in de IPR. Ze tonen ook aan dat de kromming van het meristeem eveneens de oriëntatie van het celdelingsvlak in de IPR beïnvloedt.
De transversale oriëntatie van het delingsvlak in de IPR, als gevolg van de hoge GA-signaleringsactiviteit, suggereert dat GA een radiale celrij in de epidermis binnen het SAM pre-organiseert om de cellulaire organisatie te bepalen die later in het epidermale internodium zal worden aangetroffen. Dergelijke celrijen waren inderdaad vaak zichtbaar in SAM-afbeeldingen van della global-mutanten (Fig. 6b). Om de ontwikkelingsfunctie van het ruimtelijke patroon van GA-signalering in het SAM verder te onderzoeken, hebben we daarom time-lapse-beeldvorming gebruikt om de ruimtelijke organisatie van cellen in de IPR te analyseren in wildtype (Ler en Col-0), della global-mutanten en pCUC2::gai-1-VENUS transgene planten.
We ontdekten dat qmRGA aantoonde dat de GA-signaleringsactiviteit in de IPR toenam van P1/P2 en piekte bij P4, en dat dit patroon in de loop van de tijd constant bleef (Fig. 4a–f en Aanvullende Fig. 8c–f, k). Om de ruimtelijke organisatie van cellen in de IPR met toenemend GA-signaal te analyseren, labelden we Ler IPR-cellen boven en naast P4 op basis van hun ontwikkelingsstatus, geanalyseerd 34 uur na de eerste observatie, d.w.z. meer dan twee plastidetijden. Dit stelde ons in staat om IPR-cellen te volgen tijdens de ontwikkeling van het primordium van P1/P2 tot P4. We gebruikten drie verschillende kleuren: geel voor cellen die rond P4 in het primordium waren geïntegreerd, groen voor cellen die zich in de IPR bevonden en paars voor cellen die aan beide processen deelnamen (Fig. 7a–c). Op t0 (0 uur) waren 1-2 lagen IPR-cellen zichtbaar voor P4 (Fig. 7a). Zoals verwacht, deelden deze cellen zich voornamelijk via het transversale delingsvlak (figuren 7a-c). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Col-0 SAM (met de focus op P3, waarvan de rand zich op dezelfde manier vouwt als P4 in Ler), hoewel in dit genotype de vouw die zich aan de bloemrand vormde de IPR-cellen sneller verborg (figuur 7g-i). Het delingspatroon van IPR-cellen organiseert de cellen dus in radiale rijen, net als in internodiën. De organisatie van radiale rijen en de lokalisatie van IPR-cellen tussen opeenvolgende organen suggereren dat deze cellen internodale voorlopercellen zijn.
Hier hebben we een ratiometrische GA-signaleringsbiosensor ontwikkeld, qmRGA, die kwantitatieve kartering mogelijk maakt van de GA-signaleringsactiviteit als gevolg van gecombineerde GA- en GA-receptorconcentraties, terwijl interferentie met endogene signaleringsroutes wordt geminimaliseerd. Hierdoor wordt informatie verkregen over de GA-functie op cellulair niveau. Hiertoe hebben we een gemodificeerd DELLA-eiwit, mRGA, geconstrueerd dat het vermogen om DELLA-interactiepartners te binden heeft verloren, maar wel gevoelig blijft voor GA-geïnduceerde proteolyse. qmRGA reageert op zowel exogene als endogene veranderingen in GA-niveaus, en de dynamische detectie-eigenschappen maken het mogelijk om spatiotemporele veranderingen in de GA-signaleringsactiviteit tijdens de ontwikkeling te beoordelen. qmRGA is bovendien een zeer flexibel instrument, omdat het kan worden aangepast aan verschillende weefsels door de promotor voor de expressie ervan te veranderen (indien nodig). Gezien het geconserveerde karakter van de GA-signaleringsroute en het PFYRE-motief in angiospermen, is het waarschijnlijk overdraagbaar naar andere soorten22. In overeenstemming hiermee is aangetoond dat een equivalente mutatie in het rijst-SLR1 DELLA-eiwit (HYY497AAA) ook de groeiremmende activiteit van SLR1 onderdrukt, terwijl de GA-gemedieerde afbraak ervan slechts licht wordt verminderd, vergelijkbaar met mRGA23. Opvallend is dat recente studies in Arabidopsis hebben aangetoond dat een enkele aminozuurmutatie in het PFYRE-domein (S474L) de transcriptionele activiteit van RGA verandert zonder het vermogen om met transcriptiefactorpartners te interageren te beïnvloeden50. Hoewel deze mutatie zeer dicht bij de drie aminozuursubstituties in mRGA ligt, tonen onze studies aan dat deze twee mutaties verschillende kenmerken van DELLA veranderen. Hoewel de meeste transcriptiefactorpartners binden aan de LHR1- en SAW-domeinen van DELLA26,51, kunnen sommige geconserveerde aminozuren in het PFYRE-domein deze interacties helpen stabiliseren.
De ontwikkeling van internodiën is een belangrijk kenmerk voor de plantarchitectuur en de verbetering van de opbrengst. qmRGA onthulde een hogere GA-signaleringsactiviteit in IPR-internode-voorlopercellen. Door kwantitatieve beeldvorming en genetica te combineren, toonden we aan dat GA-signaleringspatronen circulaire/transversale celdelingsvlakken in de SAM-epidermis overlappen, waardoor de celdelingsorganisatie wordt gevormd die nodig is voor de ontwikkeling van internodiën. Verschillende regulatoren van de oriëntatie van het celdelingsvlak zijn tijdens de ontwikkeling geïdentificeerd52,53. Ons werk biedt een duidelijk voorbeeld van hoe GA-signaleringsactiviteit deze cellulaire parameter reguleert. DELLA kan interageren met prefolding-eiwitcomplexen41, dus GA-signalering kan de oriëntatie van het celdelingsvlak reguleren door de oriëntatie van corticale microtubuli direct te beïnvloeden40,41,54,55. We toonden onverwacht aan dat in SAM de correlatie van hogere GA-signaleringsactiviteit niet celverlenging of -deling was, maar alleen groei-anisotropie, wat consistent is met een direct effect van GA op de richting van de celdeling in de IPR. We kunnen echter niet uitsluiten dat dit effect ook indirect kan zijn, bijvoorbeeld via GA-geïnduceerde verzachting van de celwand56. Veranderingen in de eigenschappen van de celwand veroorzaken mechanische stress57,58, wat ook de oriëntatie van het celdelingsvlak kan beïnvloeden door de oriëntatie van corticale microtubuli te beïnvloeden39,46,59. De gecombineerde effecten van GA-geïnduceerde mechanische stress en directe regulatie van de microtubuli-oriëntatie door GA kunnen betrokken zijn bij het genereren van een specifiek patroon van celdelingsoriëntatie in de IPR om internodiën te definiëren, en verder onderzoek is nodig om dit idee te testen. Eerdere studies hebben eveneens het belang benadrukt van de DELLA-interagerende eiwitten TCP14 en 15 bij de controle van internodiumvorming60,61 en deze factoren kunnen de werking van GA mediëren samen met BREVIPEDICELLUS (BP) en PENNYWISE (PNY), die de internodiumontwikkeling reguleren en waarvan is aangetoond dat ze de GA-signalering beïnvloeden2,62. Aangezien DELLAs interageren met brassinosteroïde-, ethyleen-, jasmijnzuur- en abscisinezuur (ABA)-signaalroutes63,64 en deze hormonen de oriëntatie van microtubuli kunnen beïnvloeden65, kunnen de effecten van GA op de oriëntatie van de celdeling ook door andere hormonen worden gemedieerd.
Vroege cytologische studies toonden aan dat zowel de binnenste als de buitenste delen van het Arabidopsis SAM nodig zijn voor de ontwikkeling van internodiën2,42. Het feit dat GA de celdeling in de binnenste weefsels actief reguleert12 ondersteunt een dubbele functie van GA bij het reguleren van de grootte van het meristeem en de internodiën in het SAM. Het patroon van gerichte celdeling wordt ook strak gereguleerd in het binnenste SAM-weefsel, en deze regulatie is essentieel voor stengelgroei52. Het zal interessant zijn om te onderzoeken of GA ook een rol speelt bij het oriënteren van het celdelingsvlak in de binnenste SAM-organisatie, en daarmee de specificatie en ontwikkeling van internodiën binnen het SAM synchroniseert.
Planten werden in vitro gekweekt in aarde of 1x Murashige-Skoog (MS) medium (Duchefa) aangevuld met 1% sucrose en 1% agar (Sigma) onder standaardomstandigheden (16 uur licht, 22 °C), met uitzondering van de experimenten met hypocotyl- en wortelgroei, waarbij zaailingen op verticale platen werden gekweekt onder constant licht en bij 22 °C. Voor de nitraatexperimenten werden planten gekweekt op gemodificeerd MS-medium (bioWORLD plant medium) aangevuld met een adequate hoeveelheid nitraat (0 of 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinaat, 1% sucrose en 1% A-agar (Sigma) onder lange-dagomstandigheden.
GID1a cDNA ingevoegd in pDONR221 werd gerecombineerd met pDONR P4-P1R-pUBQ10 en pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW om pUBQ10::GID1a-mCherry te genereren. IDD2 DNA ingevoegd in pDONR221 werd gerecombineerd in pB7RWG266 om p35S:IDD2-RFP te genereren. Om pGID1b::2xmTQ2-GID1b te genereren, werden eerst een fragment van 3,9 kb stroomopwaarts van het GID1b-coderingsgebied en een fragment van 4,7 kb met daarin het GID1b-cDNA (1,3 kb) en de terminator (3,4 kb) geamplificeerd met behulp van de primers in Aanvullende Tabel 3. Deze fragmenten werden vervolgens ingevoegd in respectievelijk pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) en pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), en ten slotte gerecombineerd met pDONR221 2xmTQ268 in de pGreen 012567-doelvector met behulp van Gateway-klonering. Om pCUC2::LSSmOrange te genereren, werden de CUC2-promotersequentie (3229 bp stroomopwaarts van ATG), gevolgd door de coderende sequentie van large Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 met het N7-nucleaire lokalisatiesignaal en de NOS-transcriptieterminator, in de pGreen-kanamycine-targetingvector ingebouwd met behulp van het Gateway 3-fragment recombinatiesysteem (Invitrogen). De binaire plantenvector werd geïntroduceerd in Agrobacterium tumefaciens-stam GV3101 en vervolgens in bladeren van Nicotiana benthamiana geïntroduceerd via de Agrobacterium-infiltratiemethode en in Arabidopsis thaliana Col-0 via de bloemdipmethode. pUBQ10::qmRGA, pUBQ10::GID1a-mCherry en pCLV3::mCherry-NLS qmRGA werden geïsoleerd uit respectievelijk de F3- en F1-nakomelingen van de betreffende kruisingen.
RNA-in-situ-hybridisatie werd uitgevoerd op scheutpunten van ongeveer 1 cm lang72, die werden verzameld en onmiddellijk gefixeerd in een FAA-oplossing (3,7% formaldehyde, 5% azijnzuur, 50% ethanol) die was voorgekoeld tot 4 °C. Na twee vacuümbehandelingen van 15 minuten werd het fixatiemiddel vervangen en werden de monsters een nacht geïncubeerd. De cDNA's van GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 en RGL3 en antisense-probes voor hun 3'-UTR's werden gesynthetiseerd met behulp van de primers weergegeven in Aanvullende Tabel 3, zoals beschreven door Rosier et al.73. Met digoxigenine gelabelde probes werden gedetecteerd met behulp van digoxigenine-antilichamen (3000-voudige verdunning; Roche, catalogusnummer: 11 093 274 910), en de coupes werden gekleurd met een oplossing van 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat (BCIP, 250-voudige verdunning)/nitroblauwtetrazolium (NBT, 200-voudige verdunning).
Geplaatst op: 10 februari 2025