De groei van het scheut-apisch meristeem (SAM) is cruciaal voor de stengelarchitectuur. Planthormonengibberellinen(GA's) spelen een sleutelrol bij de coördinatie van plantengroei, maar hun rol in de SAM blijft slecht begrepen. Hier hebben we een ratiometrische biosensor voor GA-signalering ontwikkeld door het DELLA-eiwit zodanig te manipuleren dat het zijn essentiële regulerende functie in de transcriptionele respons van GA onderdrukt en tegelijkertijd de afbraak ervan bij GA-herkenning behoudt. We tonen aan dat deze op afbraak gebaseerde biosensor veranderingen in GA-niveaus en cellulaire detectie tijdens de ontwikkeling nauwkeurig registreert. We gebruikten deze biosensor om de GA-signaleringactiviteit in de SAM in kaart te brengen. We tonen aan dat hoge GA-signalen voornamelijk aanwezig zijn in cellen tussen orgaanprimordia, die de voorlopers zijn van internodiën. Met behulp van gain- en loss-of-function-benaderingen tonen we verder aan dat GA de oriëntatie van het celdelingsvlak reguleert, waardoor de canonieke cellulaire organisatie van internodiën wordt vastgesteld en de internodiënspecificatie in de SAM wordt bevorderd.
Het scheut-apisch meristeem (SAM), gelegen aan de scheuttop, bevat een niche van stamcellen waarvan de activiteit op modulaire en iteratieve wijze laterale organen en stengelknopen genereert gedurende het leven van de plant. Elk van deze repeterende eenheden, of plantenknopen, omvat internodiën en laterale organen in de knopen, en okselmeristemen in de bladoksels1. De groei en organisatie van plantenknopen verandert tijdens de ontwikkeling. Bij Arabidopsis wordt de internodiëngroei onderdrukt tijdens de vegetatieve fase, en blijven okselmeristemen inactief in de oksels van rozetbladeren. Tijdens de overgang naar de bloeifase wordt het SAM het bloeiwijzemeristeem, dat langwerpige internodiën en okselknoppen, twijgen in de oksels van stengelbladeren en later bladloze bloemen2 genereert. Hoewel we aanzienlijke vooruitgang hebben geboekt in het begrijpen van de mechanismen die de ontwikkeling van bladeren, bloemen en takken regelen, is er relatief weinig bekend over het ontstaan van internodiën.
Inzicht in de spatiotemporele distributie van GA's zal helpen om de functies van deze hormonen in verschillende weefsels en in verschillende ontwikkelingsstadia beter te begrijpen. Visualisatie van de afbraak van RGA-GFP-fusie, tot expressie gebracht onder invloed van de eigen promotor, biedt belangrijke informatie over de regulatie van de totale GA-niveaus in wortels15,16. De RGA-expressie varieert echter tussen weefsels17 en wordt gereguleerd door GA18. Differentiële expressie van de RGA-promotor kan dus resulteren in het fluorescentiepatroon dat wordt waargenomen met RGA-GFP, waardoor deze methode niet kwantitatief is. Meer recent onthulde bioactief fluoresceïne (Fl)-gelabeld GA19,20 de accumulatie van GA in de wortel-endocortex en de regulatie van de cellulaire niveaus ervan door GA-transport. Onlangs toonde de GA FRET-sensor nlsGPS1 aan dat GA-niveaus correleren met celverlenging in wortels, filamenten en donker gegroeide hypocotylen21. Zoals we echter hebben gezien, is de GA-concentratie niet de enige parameter die de GA-signaleringactiviteit controleert, aangezien deze afhankelijk is van complexe detectieprocessen. Voortbouwend op ons begrip van de DELLA- en GA-signaleringsroutes, rapporteren we hier de ontwikkeling en karakterisering van een op degradatie gebaseerde ratiometrische biosensor voor GA-signalering. Om deze kwantitatieve biosensor te ontwikkelen, gebruikten we een mutant GA-gevoelig RGA dat gefuseerd was met een fluorescerend eiwit en alomtegenwoordig tot expressie kwam in weefsels, evenals een GA-ongevoelig fluorescerend eiwit. We tonen aan dat de mutante RGA-eiwitfusies de endogene GA-signalering niet verstoren wanneer ze alomtegenwoordig tot expressie komen, en dat deze biosensor de signaleringactiviteit als gevolg van zowel GA-input als GA-signaalverwerking door het sensorapparaat met een hoge spatiotemporele resolutie kan kwantificeren. We gebruikten deze biosensor om de spatiotemporele verdeling van GA-signaleringactiviteit in kaart te brengen en te kwantificeren hoe GA cellulair gedrag in de SAM-epidermis reguleert. Wij tonen aan dat GA de oriëntatie van het delingsvlak van SAM-cellen reguleert die zich tussen de orgaanprimordia bevinden en zo de canonieke cellulaire organisatie van de internodiën definieert.
Tot slot vroegen we ons af of qmRGA veranderingen in endogene GA-niveaus kon rapporteren met behulp van groeiende hypocotylen. We hebben eerder aangetoond dat nitraat de groei stimuleert door de GA-synthese en daarmee de afbraak van DELLA34 te verhogen. Dienovereenkomstig observeerden we dat de hypocotyllengte in pUBQ10::qmRGA-zaailingen die onder overvloedige nitraattoevoer (10 mM NO3−) groeiden significant langer was dan die in zaailingen die onder nitraatarme omstandigheden groeiden (aanvullende figuur 6a). Consistent met de groeirespons waren de GA-signalen hoger in hypocotylen van zaailingen die onder 10 mM NO3−-omstandigheden groeiden dan in zaailingen die zonder nitraat groeiden (aanvullende figuur 6b, c). QmRGA maakt het dus ook mogelijk om veranderingen in GA-signalering te monitoren die worden veroorzaakt door endogene veranderingen in de GA-concentratie.
Om te begrijpen of de GA-signalering die door qmRGA wordt gedetecteerd, afhankelijk is van de GA-concentratie en GA-perceptie, zoals verwacht op basis van het sensorontwerp, hebben we de expressie van de drie GID1-receptoren in vegetatieve en reproductieve weefsels geanalyseerd. Bij zaailingen toonde de GID1-GUS-reporterlijn aan dat GID1a en c sterk tot expressie kwamen in de zaadlobben (Fig. 3a–c). Bovendien kwamen alle drie de receptoren tot expressie in bladeren, de laterale wortelprimordia, de wortelpunten (behalve de wortelkap van GID1b) en het vaatstelsel (Fig. 3a–c). In de SAM van de bloeiwijze detecteerden we alleen GUS-signalen voor GID1b en 1c (Aanvullende Fig. 7a–c). In-situhybridisatie bevestigde deze expressiepatronen en toonde verder aan dat GID1c uniform en laag tot expressie kwam in de SAM, terwijl GID1b een hogere expressie vertoonde in de periferie van de SAM (Aanvullende Fig. 7d–l). De pGID1b::2xmTQ2-GID1b translationele fusie toonde ook een geleidelijke variatie in GID1b-expressie, van lage of geen expressie in het centrum van de SAM tot hoge expressie aan de orgaangrenzen (aanvullende figuur 7m). GID1-receptoren zijn dus niet gelijkmatig verdeeld over en binnen weefsels. In daaropvolgende experimenten observeerden we ook dat overexpressie van GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) de gevoeligheid van qmRGA in hypocotylen voor externe GA-toediening verhoogde (figuur 3d, e). De fluorescentie gemeten met qd17mRGA in de hypocotyl was daarentegen ongevoelig voor GA3-behandeling (figuur 3f, g). Voor beide assays werden zaailingen behandeld met hoge concentraties GA (100 μM GA3) om het snelle gedrag van de sensor te beoordelen, waarbij het vermogen om zich aan de GID1-receptor te binden werd versterkt of juist verloren ging. Samen bevestigen deze resultaten dat de qmRGA-biosensor een gecombineerde functie vervult als GA- en GA-sensor. Daarnaast suggereren ze dat differentiële expressie van de GID1-receptor de emissiviteit van de sensor aanzienlijk kan moduleren.
Tot op heden blijft de distributie van GA-signalen in de SAM onduidelijk. Daarom gebruikten we planten die qmRGA tot expressie brengen en de pCLV3::mCherry-NLS-stamcelreporter35 om kwantitatieve kaarten met hoge resolutie van de GA-signalering te berekenen, met de focus op de L1-laag (epidermis; Fig. 4a, b, zie Methoden en Aanvullende Methoden), aangezien L1 een sleutelrol speelt in de regulatie van de SAM-groei36. Hier bood pCLV3::mCherry-NLS-expressie een vast geometrisch referentiepunt voor het analyseren van de spatiotemporele distributie van GA-signalering37. Hoewel GA als essentieel wordt beschouwd voor de ontwikkeling van laterale organen4, observeerden we dat de GA-signalen laag waren in het bloemprimordium (P) vanaf het P3-stadium (Fig. 4a, b), terwijl jonge P1- en P2-primordiums een matige activiteit vertoonden, vergelijkbaar met die in de centrale regio (Fig. 4a, b). Een hogere GA-signaleringactiviteit werd gedetecteerd aan de grenzen van de primordiumorganen, beginnend bij P1/P2 (aan de zijkanten van de grens) en piekend bij P4, evenals in alle cellen van het perifere gebied tussen de primordia (Fig. 4a, b en Aanvullende Fig. 8a, b). Deze hogere GA-signaleringactiviteit werd niet alleen waargenomen in de epidermis, maar ook in de L2- en bovenste L3-lagen (Aanvullende Fig. 8b). Het patroon van GA-signalen dat in de SAM werd gedetecteerd met behulp van qmRGA bleef ook onveranderd in de tijd (Aanvullende Fig. 8c–f, k). Hoewel het qd17mRGA-construct systematisch werd onderdrukt in de SAM van T3-planten van vijf onafhankelijke lijnen die we in detail hebben gekarakteriseerd, waren we in staat de fluorescentiepatronen die werden verkregen met het pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP-construct te analyseren (Aanvullende Fig. 8g–j, l). In deze controlelijn werden slechts kleine veranderingen in de fluorescentieverhouding gedetecteerd in de SAM, maar in het SAM-centrum observeerden we een duidelijke en onverwachte afname in VENUS geassocieerd met TagBFP. Dit bevestigt dat het door qmRGA waargenomen signaalpatroon een GA-afhankelijke degradatie van mRGA-VENUS weerspiegelt, maar toont ook aan dat qmRGA de GA-signaalactiviteit in het meristeemcentrum mogelijk overschat. Samenvattend laten onze resultaten een GA-signaalpatroon zien dat voornamelijk de verdeling van primordia weerspiegelt. Deze verdeling van de interprimordiale regio (IPR) is te wijten aan de geleidelijke ontwikkeling van hoge GA-signaalactiviteit tussen het zich ontwikkelende primordium en de centrale regio, terwijl tegelijkertijd de GA-signaalactiviteit in het primordium afneemt (Fig. 4c, d).
De verdeling van GID1b- en GID1c-receptoren (zie hierboven) suggereert dat differentiële expressie van GA-receptoren het patroon van GA-signalering in de SAM helpt vormgeven. We vroegen ons af of differentiële accumulatie van GA hierbij een rol zou kunnen spelen. Om deze mogelijkheid te onderzoeken, gebruikten we de nlsGPS1 GA FRET-sensor21. Een verhoogde activeringsfrequentie werd gedetecteerd in de SAM van nlsGPS1 behandeld met 10 μM GA4+7 gedurende 100 minuten (aanvullende figuren 9a-e), wat aangeeft dat nlsGPS1 reageert op veranderingen in de GA-concentratie in de SAM, net als in de wortels21. De ruimtelijke verdeling van de nlsGPS1-activeringfrequentie onthulde relatief lage GA-niveaus in de buitenste lagen van de SAM, maar toonde aan dat deze verhoogd waren in het centrum en aan de randen van de SAM (figuur 4e en aanvullende figuren 9a,c). Dit suggereert dat GA ook in de SAM verdeeld is met een ruimtelijk patroon dat vergelijkbaar is met dat van qmRGA. Als aanvullende aanpak behandelden we de SAM ook met fluorescerende GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) of alleen met Fl als negatieve controle. Het Fl-signaal was verdeeld over de SAM, inclusief de centrale regio en het primordium, zij het met een lagere intensiteit (Fig. 4j en Aanvullende Fig. 10d). Daarentegen accumuleerden alle drie de GA-Fl-cellen specifiek binnen de primordiumgrenzen en in wisselende mate in de rest van de IPR, waarbij GA7-Fl zich accumuleerde in het grootste domein in de IPR (Fig. 4k en Aanvullende Fig. 10a,b). Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit toonde aan dat de intensiteitsverhouding tussen IPR en niet-IPR hoger was in met GA-Fl behandeld SAM vergeleken met met Fl behandeld SAM (Fig. 4l en Aanvullende Fig. 10c). Samen suggereren deze resultaten dat GA in hogere concentraties aanwezig is in IPR-cellen die zich het dichtst bij de orgaangrens bevinden. Dit suggereert dat het patroon van SAM GA-signalering voortkomt uit zowel differentiële expressie van GA-receptoren als differentiële accumulatie van GA in IPR-cellen nabij orgaangrenzen. Onze analyse onthulde dus een onverwacht spatiotemporeel patroon van GA-signalering, met lagere activiteit in het centrum en primordium van de SAM en hogere activiteit in de IPR in de perifere regio.
Om de rol van differentiële GA-signalering in de SAM te begrijpen, analyseerden we de correlatie tussen GA-signalering, celexpansie en celdeling met behulp van realtime time-lapse-imaging van de SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Gezien de rol van GA in groeiregulatie werd een positieve correlatie met celexpansieparameters verwacht. Daarom vergeleken we eerst GA-signaleringactiviteitskaarten met kaarten van de groeisnelheid van het celoppervlak (als maatstaf voor de sterkte van de celexpansie voor een bepaalde cel en voor dochtercellen bij deling) en met kaarten van groeianisotropie, die de richting van de celexpansie meet (ook hier gebruikt voor een bepaalde cel en voor dochtercellen bij deling; Fig. 5a,b, zie Methoden en Aanvullende Methoden). Onze kaarten van de groeisnelheid van het SAM-celoppervlak komen overeen met eerdere observaties38,39, met minimale groeisnelheden aan de rand en maximale groeisnelheden in ontwikkelende bloemen (Fig. 5a). Principale componentenanalyse (PCA) toonde aan dat de GA-signalering negatief gecorreleerd was met de intensiteit van de celoppervlaktegroei (Figuur 5c). We toonden ook aan dat de belangrijkste variatieassen, waaronder de GA-signalering en de groei-intensiteit, orthogonaal stonden ten opzichte van de richting bepaald door een hoge CLV3-expressie, wat de uitsluiting van cellen uit het SAM-centrum in de overige analyses bevestigde. Spearman-correlatieanalyse bevestigde de PCA-resultaten (Figuur 5d), wat erop wees dat hogere GA-signalen in de IPR niet resulteerden in een hogere celexpansie. Correlatieanalyse toonde echter een licht positieve correlatie aan tussen GA-signalering en groeianisotropie (Figuur 5c, d), wat suggereert dat hogere GA-signalering in de IPR de richting van de celgroei en mogelijk de positie van het celdelingsvlak beïnvloedt.
a, b Heatmaps van gemiddelde oppervlaktegroei (a) en groeianisotropie (b) in SAM gemiddeld over zeven onafhankelijke planten (respectievelijk gebruikt als proxy's voor de sterkte en richting van celexpansie). c PCA-analyse omvatte de volgende variabelen: GA-signaal, intensiteit van oppervlaktegroei, anisotropie van oppervlaktegroei en CLV3-expressie. PCA-component 1 was voornamelijk negatief gecorreleerd met de intensiteit van oppervlaktegroei en positief gecorreleerd met het GA-signaal. PCA-component 2 was voornamelijk positief gecorreleerd met anisotropie van oppervlaktegroei en negatief gecorreleerd met CLV3-expressie. Percentages geven de variatie weer die door elke component wordt verklaard. d Spearman-correlatieanalyse tussen GA-signaal, intensiteit van oppervlaktegroei en anisotropie van oppervlaktegroei op weefselniveau exclusief CZ. Het getal aan de rechterkant is de Spearman rho-waarde tussen twee variabelen. Asterisken geven gevallen aan waarin de correlatie/negatieve correlatie zeer significant is. e 3D-visualisatie van Col-0 SAM L1-cellen door confocale microscopie. Nieuwe celwanden gevormd in de SAM (maar niet het primordium) na 10 uur zijn gekleurd volgens hun hoekwaarden. De kleurenbalk wordt weergegeven in de rechter benedenhoek. De inzet toont de overeenkomstige 3D-afbeelding na 0 uur. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. f Boxplots tonen celdelingssnelheden in IPR en niet-IPR Col-0 SAM (n = 10 onafhankelijke planten). De middenlijn geeft de mediaan aan en de kadergrenzen geven het 25e en 75e percentiel aan. Snorharen geven de minimum- en maximumwaarden aan die zijn bepaald met R-software. P-waarden werden verkregen met de tweezijdige t-toets van Welch. g, h Schematisch diagram dat (g) laat zien hoe de hoek van de nieuwe celwand (magenta) moet worden gemeten ten opzichte van de radiale richting vanuit het midden van de SAM (witte stippellijn) (alleen scherpe hoekwaarden, d.w.z. 0–90°, worden beschouwd), en (h) de circumferentiële/laterale en radiale richtingen binnen het meristeem. i Frequentiehistogrammen van de oriëntatie van het celdelingsvlak rond respectievelijk SAM (donkerblauw), IPR (middenblauw) en non-IPR (lichtblauw). P-waarden werden verkregen met een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-toets. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. j Frequentiehistogrammen van de oriëntatie van het celdelingsvlak van IPR rond respectievelijk P3 (lichtgroen), P4 (middengroen) en P5 (donkergroen). P-waarden werden verkregen met een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-toets. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten.
Daarom onderzochten we vervolgens de correlatie tussen GA-signalering en celdelingsactiviteit door nieuwgevormde celwanden tijdens de assay te identificeren (Fig. 5e). Deze aanpak stelde ons in staat de frequentie en richting van de celdeling te meten. Verrassend genoeg ontdekten we dat de frequentie van celdelingen in de IPR en de rest van de SAM (niet-IPR, Fig. 5f) vergelijkbaar was, wat aangeeft dat verschillen in GA-signalering tussen IPR- en niet-IPR-cellen de celdeling niet significant beïnvloeden. Dit, en de positieve correlatie tussen GA-signalering en groeianisotropie, zette ons ertoe aan om te onderzoeken of GA-signalering de oriëntatie van het celdelingsvlak zou kunnen beïnvloeden. We maten de oriëntatie van de nieuwe celwand als een scherpe hoek ten opzichte van de radiale as die het meristeemcentrum en het centrum van de nieuwe celwand verbindt (Fig. 5e-i) en observeerden een duidelijke neiging van cellen om te delen onder hoeken van bijna 90° ten opzichte van de radiale as, met de hoogste frequenties waargenomen bij 70-80° (23,28%) en 80-90° (22,62%) (Fig. 5e,i), overeenkomend met celdelingen in de circumferentiële/transversale richting (Fig. 5h). Om de bijdrage van GA-signalering aan dit celdelingsgedrag te onderzoeken, analyseerden we de celdelingsparameters in de IPR en niet-IPR afzonderlijk (Fig. 5i). We observeerden dat de verdeling van de delingshoek in IPR-cellen verschilde van die in niet-IPR-cellen of in cellen in de gehele SAM, waarbij IPR-cellen een hoger percentage laterale/circulaire celdelingen vertoonden, namelijk 70-80° en 80-90° (respectievelijk 33,86% en 30,71%, corresponderende percentages) (Fig. 5i). Onze waarnemingen lieten dus een verband zien tussen hoge GA-signalering en een oriëntatie van het celdelingsvlak dicht bij de circumferentiële richting, vergelijkbaar met de correlatie tussen GA-signalering en groeianisotropie (Fig. 5c, d). Om de ruimtelijke conservatie van dit verband verder vast te stellen, hebben we de oriëntatie van het delingsvlak gemeten in IPR-cellen rondom het primordium, beginnend bij P3, aangezien de hoogste GA-signaleringactiviteit in dit gebied werd gedetecteerd, beginnend bij P4 (Fig. 4). De delingshoeken van de IPR rond P3 en P4 vertoonden geen statistisch significante verschillen, hoewel een verhoogde frequentie van laterale celdelingen werd waargenomen in de IPR rond P4 (Fig. 5j). In de IPR-cellen rond P5 werd het verschil in de oriëntatie van het celdelingsvlak echter statistisch significant, met een sterke toename in de frequentie van transversale celdelingen (Fig. 5j). Samen suggereren deze resultaten dat GA-signalering de oriëntatie van celdelingen in de SAM kan controleren, wat consistent is met eerdere rapporten40,41 dat hoge GA-signalering laterale oriëntatie van celdelingen in de IPR kan induceren.
Er wordt voorspeld dat cellen in de IPR niet in primordia zullen worden opgenomen, maar in internodiën2,42,43. De transversale oriëntatie van celdelingen in de IPR kan resulteren in de typische organisatie van parallelle longitudinale rijen epidermiscellen in internodiën. Onze hierboven beschreven observaties suggereren dat GA-signalering waarschijnlijk een rol speelt in dit proces door de richting van de celdeling te reguleren.
Het verlies van de functie van verschillende DELLA-genen resulteert in een constitutieve GA-respons, en della-mutanten kunnen worden gebruikt om deze hypothese te testen44. We analyseerden eerst de expressiepatronen van vijf DELLA-genen in de SAM. Transcriptionele fusie van de GUS-lijn45 toonde aan dat GAI, RGA, RGL1 en RGL2 (in veel mindere mate) tot expressie kwamen in de SAM (aanvullende figuur 11a-d). In-situhybridisatie toonde verder aan dat GAI-mRNA zich specifiek ophoopt in primordia en zich ontwikkelende bloemen (aanvullende figuur 11e). RGL1- en RGL3-mRNA werden gedetecteerd in het gehele bladerdak van de SAM en in oudere bloemen, terwijl RGL2-mRNA overvloediger aanwezig was in de randregio (aanvullende figuur 11f-h). Confocale beeldvorming van pRGL3::RGL3-GFP SAM bevestigde de expressie die werd waargenomen bij in-situhybridisatie en toonde aan dat RGL3-eiwit zich ophoopt in het centrale deel van het SAM (aanvullende figuur 11i). Met behulp van de pRGA::GFP-RGA-lijn ontdekten we ook dat RGA-eiwit zich ophoopt in het SAM, maar dat de hoeveelheid ervan afneemt aan de grens vanaf P4 (aanvullende figuur 11j). Opvallend is dat de expressiepatronen van RGL3 en RGA consistent zijn met een hogere GA-signaalactiviteit in de IPR, zoals gedetecteerd door qmRGA (figuur 4). Bovendien geven deze gegevens aan dat alle DELLA's tot expressie komen in het SAM en dat hun expressie collectief het gehele SAM beslaat.
Vervolgens analyseerden we de celdelingsparameters in de wildtype SAM (Ler, controle) en de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutanten (Fig. 6a, b). Interessant genoeg observeerden we een statistisch significante verschuiving in de verdeling van de frequenties van de celdelingshoeken in de della global mutant SAM ten opzichte van het wildtype (Fig. 6c). Deze verandering in de della global mutant was te wijten aan een toename in de frequentie van hoeken van 80-90° (34,71% vs. 24,55%) en, in mindere mate, hoeken van 70-80° (23,78% vs. 20,18%), d.w.z. overeenkomend met transversale celdelingen (Fig. 6c). De frequentie van niet-transversale delingen (0-60°) was ook lager in de della global mutant (Fig. 6c). De frequentie van transversale celdelingen was significant verhoogd in de SAM van de della global-mutant (Fig. 6b). De frequentie van transversale celdelingen in de IPR was ook hoger in de della global-mutant vergeleken met het wildtype (Fig. 6d). Buiten het IPR-gebied had het wildtype een gelijkmatigere verdeling van de celdelingshoeken, terwijl de della global-mutant de voorkeur gaf aan tangentiële celdelingen zoals de IPR (Fig. 6e). We kwantificeerden ook de oriëntatie van de celdelingen in de SAM van ga2-oxidase (ga2ox) quintuple-mutanten (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 en ga2ox6-2), een GA-inactieve mutantachtergrond waarin GA zich ophoopt. In overeenstemming met de toename van de GA-niveaus was de SAM van de vijfvoudige ga2ox-mutante bloeiwijze groter dan die van Col-0 (aanvullende figuur 12a, b). Vergeleken met Col-0 vertoonde de vijfvoudige ga2ox SAM een duidelijk andere verdeling van celdelingshoeken, waarbij de hoekfrequentie toenam van 50° tot 90°, wat dus opnieuw tangentiële delingen bevoordeelde (aanvullende figuur 12a-c). We tonen dus aan dat constitutieve activering van GA-signalering en GA-accumulatie laterale celdelingen in de IPR en de rest van de SAM induceren.
a, b 3D-visualisatie van de L1-laag van PI-gekleurde Ler (a) en globale della-mutant (b) SAM met behulp van confocale microscopie. Nieuwe celwanden gevormd in de SAM (maar niet het primordium) gedurende een periode van 10 uur worden weergegeven en gekleurd volgens hun hoekwaarden. De inzet toont de SAM op 0 uur. De kleurenbalk wordt weergegeven in de rechter benedenhoek. De pijl in (b) wijst naar een voorbeeld van uitgelijnde celbestanden in de globale della-mutant. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. ce vergelijking van de frequentieverdeling van celdelingsvlakoriëntaties in de gehele SAM (d), IPR (e) en niet-IPR (f) tussen Ler en globale della. P-waarden werden verkregen met behulp van een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-test. f, g 3D-visualisatie van confocale beelden van PI-gekleurde SAM van Col-0 (i) en pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgene planten. Panelen (a, b) tonen de vorming van nieuwe celwanden (maar geen primordia) in de SAM binnen 10 uur. Het experiment werd tweemaal herhaald met vergelijkbare resultaten. h–j Vergelijking van de frequentieverdeling van de oriëntaties van het celdelingsvlak in de gehele SAM (h), IPR (i) en niet-IPR (j) tussen Col-0 en pCUC2::gai-1-VENUS planten. P-waarden werden verkregen met behulp van een tweezijdige Kolmogorov-Smirnov-toets.
Vervolgens testten we het effect van het remmen van GA-signalering specifiek in de IPR. Hiervoor gebruikten we de cotyledon cup 2 (CUC2)-promotor om de expressie van een dominant negatief gai-1-eiwit gefuseerd aan VENUS (in de pCUC2::gai-1-VENUS-lijn) aan te sturen. In de wildtype SAM stimuleert de CUC2-promotor de expressie van de meeste IPR's in de SAM, inclusief bordercellen, vanaf P4, en een vergelijkbare specifieke expressie werd waargenomen in pCUC2::gai-1-VENUS-planten (zie hieronder). De verdeling van de celdelingshoeken over de SAM of IPR van pCUC2::gai-1-VENUS-planten verschilde niet significant van die van het wildtype, hoewel we onverwachts ontdekten dat cellen zonder IPR in deze planten zich met een hogere frequentie van 80-90° deelden (Fig. 6f-j).
Er is gesuggereerd dat de richting van de celdeling afhangt van de geometrie van de SAM, met name de trekspanning die wordt gegenereerd door de kromming van het weefsel46. We vroegen ons daarom af of de vorm van de SAM was veranderd in de della global mutant en pCUC2::gai-1-VENUS planten. Zoals eerder gerapporteerd12, was de grootte van de della global mutant SAM groter dan die van het wildtype (aanvullende figuur 13a, b, d). In-situhybridisatie van CLV3 en STM-RNA bevestigde de meristeemexpansie in della mutanten en toonde verder de laterale expansie van de stamcelniche aan (aanvullende figuur 13e, f, h, i). De kromming van de SAM was echter vergelijkbaar in beide genotypes (aanvullende figuur 13k, m, n, p). We observeerden een vergelijkbare toename in grootte in de gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutant zonder een verandering in kromming vergeleken met het wildtype (aanvullende figuur 13c, d, g, j, l, o, p). De frequentie van de celdelingsoriëntatie werd ook beïnvloed in de della quadruple mutant, maar in mindere mate dan in de della monolithische mutant (aanvullende figuur 12d-f). Dit doseringseffect, samen met het ontbreken van een effect op de kromming, suggereert dat de resterende RGL3-activiteit in de Della quadruple mutant de veranderingen in celdelingsoriëntatie veroorzaakt door verlies van DELLA-activiteit beperkt en dat veranderingen in laterale celdelingen optreden als reactie op veranderingen in GA-signaleringactiviteit in plaats van veranderingen in SAM-geometrie. Zoals hierboven beschreven, stuurt de CUC2-promotor de IPR-expressie aan in de SAM, beginnend bij P4 (aanvullende figuur 14a, b), en daarentegen had de pCUC2::gai-1-VENUS SAM een kleinere omvang maar een hogere kromming (aanvullende figuur 14c-h). Deze verandering in de morfologie van de pCUC2::gai-1-VENUS SAM kan resulteren in een andere verdeling van mechanische spanningen in vergelijking met het wildtype, waarbij hoge circumferentiële spanningen beginnen op een kortere afstand van het SAM-centrum47. Als alternatief kunnen de veranderingen in de morfologie van de pCUC2::gai-1-VENUS SAM het gevolg zijn van veranderingen in regionale mechanische eigenschappen, geïnduceerd door transgeenexpressie48. In beide gevallen zou dit de effecten van veranderingen in GA-signalering gedeeltelijk kunnen compenseren door de kans te vergroten dat cellen zich in de circumferentiële/transversale oriëntatie delen, wat onze observaties verklaart.
Samengevat bevestigen onze gegevens dat een hogere GA-signalering een actieve rol speelt in de laterale oriëntatie van het celdelingsvlak in de IPR. Ze tonen ook aan dat meristeemkromming ook de oriëntatie van het celdelingsvlak in de IPR beïnvloedt.
De transversale oriëntatie van het delingsvlak in de IPR, als gevolg van de hoge GA-signaleringsactiviteit, suggereert dat GA een radiaal celbestand preorganiseert in de epidermis binnen de SAM om de cellulaire organisatie te definiëren die later in de epidermale internode zal worden gevonden. Dergelijke celbestanden waren inderdaad vaak zichtbaar in SAM-beelden van della global-mutanten (Fig. 6b). Om de ontwikkelingsfunctie van het ruimtelijke patroon van GA-signalering in de SAM verder te onderzoeken, gebruikten we daarom time-lapse imaging om de ruimtelijke organisatie van cellen in de IPR te analyseren in wildtype (Ler en Col-0), della global-mutanten en pCUC2::gai-1-VENUS-transgene planten.
We ontdekten dat qmRGA aantoonde dat de GA-signalering in de IPR toenam van P1/P2 tot een piek bij P4, en dat dit patroon in de loop van de tijd constant bleef (Fig. 4a–f en Aanvullende Fig. 8c–f, k). Om de ruimtelijke organisatie van cellen in de IPR te analyseren bij een toenemend GA-signaal, labelden we Ler IPR-cellen boven en naast P4 op basis van hun ontwikkelingsbestemming, geanalyseerd 34 uur na de eerste observatie, d.w.z. meer dan twee plastidetijden. Dit stelde ons in staat om IPR-cellen te volgen tijdens de ontwikkeling van het primordium van P1/P2 tot P4. We gebruikten drie verschillende kleuren: geel voor de cellen die in het primordium nabij P4 waren geïntegreerd, groen voor de cellen in de IPR en paars voor de cellen die aan beide processen deelnamen (Fig. 7a–c). Op t0 (0 uur) waren 1–2 lagen IPR-cellen zichtbaar vóór P4 (Fig. 7a). Zoals verwacht, deelden deze cellen zich voornamelijk via het transversale delingsvlak (Fig. 7a-c). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Col-0 SAM (met focus op P3, waarvan de randplooien vergelijkbaar zijn met die van P4 in Ler), hoewel in dit genotype de plooi die zich aan de bloemrand vormde de IPR-cellen sneller verborg (Fig. 7g-i). Het delingspatroon van IPR-cellen zorgt er dus voor dat de cellen zich pre-organiseren in radiale rijen, zoals bij internodiën. De organisatie van radiale rijen en de lokalisatie van IPR-cellen tussen opeenvolgende organen suggereren dat deze cellen internodiën-progenitorcellen zijn.
Hier hebben we een ratiometrische GA-signaleringsbiosensor ontwikkeld, qmRGA, die kwantitatieve mapping van de GA-signaleringsactiviteit mogelijk maakt als gevolg van gecombineerde GA- en GA-receptorconcentraties, terwijl de interferentie met endogene signaleringsroutes wordt geminimaliseerd en zo informatie verschaft over de GA-functie op cellulair niveau. Hiervoor hebben we een gemodificeerd DELLA-eiwit, mRGA, geconstrueerd dat de mogelijkheid heeft verloren om DELLA-interactiepartners te binden, maar nog steeds gevoelig is voor GA-geïnduceerde proteolyse. qmRGA reageert op zowel exogene als endogene veranderingen in GA-niveaus, en de dynamische detectie-eigenschappen maken het mogelijk om spatiotemporele veranderingen in GA-signaleringsactiviteit tijdens de ontwikkeling te beoordelen. qmRGA is ook een zeer flexibel instrument, omdat het kan worden aangepast aan verschillende weefsels door de promotor die voor de expressie wordt gebruikt te veranderen (indien nodig). Gezien de geconserveerde aard van de GA-signaleringsroute en het PFYRE-motief in bedektzadigen, is het waarschijnlijk overdraagbaar naar andere soorten22. In overeenstemming hiermee werd aangetoond dat een equivalente mutatie in het rijst SLR1 DELLA-eiwit (HYY497AAA) ook de groeiremmeractiviteit van SLR1 onderdrukte, terwijl de GA-gemedieerde afbraak ervan slechts licht werd verminderd, vergelijkbaar met mRGA23. Recente studies in Arabidopsis toonden met name aan dat een enkele aminozuurmutatie in het PFYRE-domein (S474L) de transcriptionele activiteit van RGA veranderde zonder het vermogen ervan om te interageren met transcriptiefactorpartners te beïnvloeden50. Hoewel deze mutatie zeer dicht bij de 3 aminozuursubstituties in mRGA ligt, tonen onze studies aan dat deze twee mutaties verschillende kenmerken van DELLA veranderen. Hoewel de meeste transcriptiefactorpartners binden aan de LHR1- en SAW-domeinen van DELLA26,51, kunnen sommige geconserveerde aminozuren in het PFYRE-domein deze interacties helpen stabiliseren.
De ontwikkeling van internoden is een belangrijk kenmerk in de plantenarchitectuur en opbrengstverbetering. qmRGA toonde een hogere GA-signaleringsactiviteit aan in IPR-internode-voorlopercellen. Door kwantitatieve beeldvorming en genetica te combineren, toonden we aan dat GA-signaleringspatronen circulaire/transversale celdelingsvlakken in de SAM-epidermis overlappen en zo de celdelingsorganisatie vormen die nodig is voor de ontwikkeling van internoden. Verschillende regulatoren van de oriëntatie van het celdelingsvlak zijn tijdens de ontwikkeling geïdentificeerd52,53. Ons werk biedt een duidelijk voorbeeld van hoe GA-signaleringsactiviteit deze cellulaire parameter reguleert. DELLA kan interageren met prefolding-eiwitcomplexen41, dus GA-signalering kan de oriëntatie van het celdelingsvlak reguleren door de oriëntatie van corticale microtubuli direct te beïnvloeden40,41,54,55. We toonden onverwachts aan dat in SAM de correlatie van hogere GA-signaleringsactiviteit niet celverlenging of -deling was, maar alleen groeianisotropie, wat consistent is met een direct effect van GA op de richting van de celdeling in de IPR. We kunnen echter niet uitsluiten dat dit effect ook indirect kan zijn, bijvoorbeeld gemedieerd door GA-geïnduceerde celwandverzachting56. Veranderingen in celwandeigenschappen induceren mechanische stress57,58, wat ook de oriëntatie van het celdelingsvlak kan beïnvloeden door de oriëntatie van corticale microtubuli te beïnvloeden39,46,59. De gecombineerde effecten van GA-geïnduceerde mechanische stress en directe regulatie van de microtubuli-oriëntatie door GA kunnen betrokken zijn bij het genereren van een specifiek patroon van celdelingsoriëntatie in de IPR om internodiën te definiëren, en verder onderzoek is nodig om dit idee te testen. Evenzo hebben eerdere studies het belang benadrukt van de DELLA-interagerende eiwitten TCP14 en 15 bij de controle van internodiënvorming60,61 en deze factoren kunnen de werking van GA mediëren samen met BREVIPEDICELLUS (BP) en PENNYWISE (PNY), die de internodiënontwikkeling reguleren en waarvan is aangetoond dat ze de GA-signalering beïnvloeden2,62. Aangezien DELLAs interacteren met de signaalroutes van brassinosteroïden, ethyleen, jasmonzuur en abscisinezuur (ABA)63,64 en dat deze hormonen de oriëntatie van microtubuli kunnen beïnvloeden65, kunnen de effecten van GA op de oriëntatie van de celdeling ook door andere hormonen worden gemedieerd.
Vroege cytologische studies toonden aan dat zowel de binnenste als de buitenste delen van de SAM van Arabidopsis nodig zijn voor de ontwikkeling van internodiën2,42. Het feit dat GA actief de celdeling in de binnenste weefsels reguleert12 ondersteunt een dubbele functie van GA bij het reguleren van het meristeem en de internodiëngrootte in de SAM. Het patroon van gerichte celdeling wordt ook strak gereguleerd in het binnenste SAM-weefsel, en deze regulatie is essentieel voor de groei van de stam52. Het zal interessant zijn om te onderzoeken of GA ook een rol speelt bij het oriënteren van het celdelingsvlak in de binnenste SAM-organisatie, en zo de specificatie en ontwikkeling van internodiën binnen de SAM synchroniseert.
De planten werden in vitro gekweekt in aarde of 1x Murashige-Skoog (MS)-medium (Duchefa), aangevuld met 1% sucrose en 1% agar (Sigma) onder standaardomstandigheden (16 uur licht, 22 °C), met uitzondering van experimenten met hypocotyl en wortelgroei, waarbij zaailingen op verticale platen werden gekweekt onder constant licht en bij 22 °C. Voor nitraatexperimenten werden de planten gekweekt op gemodificeerd MS-medium (bioWORLD-plantenmedium), aangevuld met voldoende nitraat (0 of 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-succinaat, 1% sucrose en 1% A-agar (Sigma) onder langedagomstandigheden.
GID1a-cDNA ingevoegd in pDONR221 werd gerecombineerd met pDONR P4-P1R-pUBQ10 en pDONR P2R-P3-mCherry in pB7m34GW om pUBQ10::GID1a-mCherry te genereren. IDD2-DNA ingevoegd in pDONR221 werd gerecombineerd in pB7RWG266 om p35S:IDD2-RFP te genereren. Om pGID1b::2xmTQ2-GID1b te genereren, werden een fragment van 3,9 kb stroomopwaarts van het coderende gebied van GID1b en een fragment van 4,7 kb dat het GID1b cDNA (1,3 kb) en de terminator (3,4 kb) bevat, eerst versterkt met behulp van de primers in aanvullende tabel 3 en vervolgens respectievelijk ingevoegd in pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) en pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) en ten slotte opnieuw gecombineerd met pDONR221 2xmTQ268 in de pGreen 012567-doelvector met behulp van Gateway-klonering. Om pCUC2::LSSmOrange te genereren, werden de CUC2-promotorsequentie (3229 bp stroomopwaarts van ATG), gevolgd door de coderende sequentie van grote Stokes-verschoven mOrange (LSSmOrange)69 met het N7-kernlokalisatiesignaal en de NOS-transcriptieterminator, samengevoegd tot de pGreen-kanamycinetargetingvector met behulp van het Gateway 3-fragment-recombinatiesysteem (Invitrogen). De binaire plantenvector werd respectievelijk geïntroduceerd in Agrobacterium tumefaciens-stam GV3101 en in Nicotiana benthamiana-bladeren met behulp van de Agrobacterium-infiltratiemethode en in Arabidopsis thaliana Col-0 met behulp van de floral dip-methode. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry en pCLV3::mCherry-NLS qmRGA werden geïsoleerd uit respectievelijk de F3- en F1-nakomelingen van de respectievelijke kruisingen.
RNA-in-situhybridisatie werd uitgevoerd op ongeveer 1 cm lange scheuttoppen72, die werden verzameld en direct gefixeerd in een FAA-oplossing (3,7% formaldehyde, 5% azijnzuur, 50% ethanol) die vooraf was afgekoeld tot 4 °C. Na 2 x 15 minuten vacuümbehandeling werd het fixeermiddel vervangen en werden de monsters een nacht geïncubeerd. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 en RGL3 cDNA's en antisense-probes voor hun 3'-UTR's werden gesynthetiseerd met behulp van de primers weergegeven in aanvullende tabel 3, zoals beschreven door Rosier et al.73. Met digoxigenine gelabelde probes werden immuungedetecteerd met behulp van digoxigenine-antilichamen (3000-voudige verdunning; Roche, catalogusnummer: 11 093 274 910), en secties werden gekleurd met 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (BCIP, 250-voudige verdunning)/nitroblauwtetrazolium (NBT, 200-voudige verdunning)-oplossing.
Plaatsingstijd: 10-02-2025