In deze studie werden de stimulerende effecten van de gecombineerde behandeling vanplantengroeiregulatorenDe effecten van 2,4-D en kinetine en ijzeroxide-nanodeeltjes (Fe₃O₄-NPs) op de in vitro morfogenese en de productie van secundaire metabolieten in *Hypericum perforatum* L. werden onderzocht. De geoptimaliseerde behandeling [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetine (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] verbeterde de groeiparameters van de plant aanzienlijk: de planthoogte nam toe met 59,6%, de wortellengte met 114,0%, het aantal knoppen met 180,0% en het versgewicht van het callus met 198,3% in vergelijking met de controlegroep. Deze gecombineerde behandeling verbeterde ook de regeneratie-efficiëntie (50,85%) en verhoogde het hypericinegehalte met 66,6%. GC-MS-analyse toonde hoge concentraties hyperoside, β-patholeen en cetylalcohol aan, goed voor 93,36% van het totale piekoppervlak, terwijl de concentraties van totale fenolen en flavonoïden met maar liefst 80,1% toenamen. Deze resultaten wijzen erop dat plantengroeiregulatoren (PGR's) en Fe₃O₄-nanodeeltjes (Fe₃O₄-NP's) een synergetisch effect hebben door de organogenese en de accumulatie van bioactieve stoffen te stimuleren. Dit vertegenwoordigt een veelbelovende strategie voor de biotechnologische verbetering van medicinale planten.
Sint-Janskruid (Hypericum perforatum L.), ook wel bekend als Sint-Janskruid, is een meerjarige kruidachtige plant uit de familie Hypericaceae met economische waarde.[1] De potentiële bioactieve bestanddelen omvatten natuurlijke tannines, xanthones, floroglucinol, naftaleendianthrone (hyperine en pseudohyperine), flavonoïden, fenolzuren en etherische oliën.[2,3,4] Sint-Janskruid kan worden vermeerderd met traditionele methoden; de seizoensgebondenheid van traditionele methoden, de lage kiemkracht van zaden en de gevoeligheid voor ziekten beperken echter het potentieel voor grootschalige teelt en de continue vorming van secundaire metabolieten.[1,5,6]
In vitro weefselkweek wordt daarom beschouwd als een effectieve methode voor snelle plantenvermeerdering, het behoud van kiemplasmabronnen en een verhoogde opbrengst van medicinale verbindingen [7, 8]. Plantengroeiregulatoren (PGR's) spelen een cruciale rol bij het reguleren van de morfogenese en zijn noodzakelijk voor de in vitro kweek van callus en hele organismen. Optimalisatie van hun concentraties en combinaties is cruciaal voor het succesvol voltooien van deze ontwikkelingsprocessen [9]. Het is daarom belangrijk om de juiste samenstelling en concentratie van regulatoren te begrijpen om de groei en het regeneratieve vermogen van sint-janskruid (H. perforatum) te verbeteren [10].
IJzeroxide-nanodeeltjes (Fe₃O₄) vormen een klasse nanodeeltjes die ontwikkeld zijn of worden voor weefselkweek. Fe₃O₄ heeft aanzienlijke magnetische eigenschappen, een goede biocompatibiliteit en het vermogen om plantengroei te bevorderen en omgevingsstress te verminderen, waardoor het veel aandacht heeft gekregen in het ontwerp van weefselkweeksystemen. Potentiële toepassingen van deze nanodeeltjes kunnen onder meer het optimaliseren van in vitro-kweek om celdeling te bevorderen, de opname van voedingsstoffen te verbeteren en antioxidatieve enzymen te activeren omvatten [11].
Hoewel nanodeeltjes een goed bevorderend effect op de plantengroei hebben laten zien, zijn studies naar de gecombineerde toepassing van Fe₃O₄-nanodeeltjes en geoptimaliseerde plantengroeiregulatoren in *H. perforatum* schaars. Om deze kennislacune op te vullen, evalueerde deze studie de effecten van hun gecombineerde werking op de in vitro morfogenese en de productie van secundaire metabolieten, om zo nieuwe inzichten te verschaffen voor het verbeteren van de eigenschappen van medicinale planten. Deze studie heeft daarom twee doelstellingen: (1) het optimaliseren van de concentratie van plantengroeiregulatoren om de callusvorming, scheutregeneratie en wortelvorming in vitro effectief te bevorderen; en (2) het evalueren van de effecten van Fe₃O₄-nanodeeltjes op de groeiparameters in vitro. Toekomstige plannen omvatten het evalueren van de overlevingskans van geregenereerde planten tijdens acclimatisatie (in vitro). Naar verwachting zullen de resultaten van deze studie de efficiëntie van de micropropagatie van *H. perforatum* aanzienlijk verbeteren, en zo bijdragen aan het duurzame gebruik en de biotechnologische toepassingen van deze belangrijke medicinale plant.
In deze studie verkregen we bladexplanten van in het veld geteelde eenjarige sint-janskruidplanten (moederplanten). Deze explanten werden gebruikt om de in vitro kweekomstandigheden te optimaliseren. Voor de kweek werden de bladeren grondig afgespoeld onder stromend gedestilleerd water gedurende enkele minuten. De oppervlakken van de explanten werden vervolgens gedesinfecteerd door ze 30 seconden onder te dompelen in 70% ethanol, gevolgd door onderdompeling in een 1,5% natriumhypochloriet (NaOCl)-oplossing met een paar druppels Tween 20 gedurende 10 minuten. Ten slotte werden de explanten driemaal afgespoeld met steriel gedestilleerd water alvorens ze naar het volgende kweekmedium werden overgebracht.
Gedurende de volgende vier weken werden parameters voor scheutregeneratie gemeten, waaronder de regeneratiesnelheid, het aantal scheuten per explant en de scheutlengte. Zodra de geregenereerde scheuten een lengte van minimaal 2 cm hadden bereikt, werden ze overgebracht naar een bewortelingsmedium bestaande uit halfsterk MS-medium, 0,5 mg/L indolboterzuur (IBA) en 0,3% guargom. De bewortelingscultuur werd drie weken voortgezet, gedurende welke tijd de bewortelingssnelheid, het aantal wortels en de wortellengte werden gemeten. Elke behandeling werd driemaal herhaald, met 10 explanten per herhaling, wat resulteerde in ongeveer 30 explanten per behandeling.
De planthoogte werd gemeten in centimeters (cm) met behulp van een liniaal, van de basis van de plant tot de punt van het hoogste blad. De wortellengte werd gemeten in millimeters (mm) direct nadat de zaailingen voorzichtig waren verwijderd en het groeimedium was weggehaald. Het aantal knoppen per explant werd direct op elke plant geteld. Het aantal zwarte vlekken op de bladeren, ook wel knobbeltjes genoemd, werd visueel gemeten. Deze zwarte knobbeltjes worden beschouwd als klieren die hypericine bevatten, oftewel oxidatieve vlekken, en worden gebruikt als fysiologische indicator voor de reactie van de plant op de behandeling. Nadat al het groeimedium was verwijderd, werd het verse gewicht van de zaailingen gemeten met een elektronische weegschaal met een nauwkeurigheid van milligrammen (mg).
De methode voor het berekenen van de callusvormingssnelheid is als volgt: na het kweken van explanten in een medium met verschillende groeiregulatoren (kinasen, 2,4-D en Fe3O4) gedurende vier weken, wordt het aantal explanten geteld dat in staat is callus te vormen. De formule voor het berekenen van de callusvormingssnelheid is als volgt:
Elke behandeling werd driemaal herhaald, waarbij in elke herhaling minstens 10 explantaten werden onderzocht.
De regeneratiesnelheid geeft het percentage callusweefsel weer dat na de callusvormingsfase het differentiatieproces tot knop succesvol doorloopt. Deze indicator toont het vermogen van callusweefsel om zich te transformeren tot gedifferentieerd weefsel en uit te groeien tot nieuwe plantenorganen.
De bewortelingscoëfficiënt is de verhouding tussen het aantal takken dat kan bewortelen en het totale aantal takken. Deze indicator geeft het succes van de bewortelingsfase weer, wat cruciaal is bij micropropagatie en plantenvermeerdering, aangezien een goede beworteling de overlevingskansen van zaailingen onder groeiomstandigheden vergroot.
Hypericineverbindingen werden geëxtraheerd met 90% methanol. Vijftig mg gedroogd plantmateriaal werd toegevoegd aan 1 ml methanol en gedurende 20 minuten gesoniceerd bij 30 kHz in een ultrasone reiniger (model A5120-3YJ) bij kamertemperatuur in het donker. Na sonificatie werd het monster gedurende 15 minuten gecentrifugeerd bij 6000 tpm. Het supernatant werd opgevangen en de absorptie van hypericine werd gemeten bij 592 nm met behulp van een Plus-3000 S spectrofotometer volgens de methode beschreven door Conceiçao et al. [14].
De meeste behandelingen met plantengroeiregulatoren (PGR's) en ijzeroxide-nanodeeltjes (Fe₃O₄-NPs) induceerden geen zwarte knobbeltjesvorming op geregenereerde scheutbladeren. Er werden geen knobbeltjes waargenomen bij de behandelingen met 0,5 of 1 mg/L 2,4-D, 0,5 of 1 mg/L kinetine, of 1, 2 of 4 mg/L ijzeroxide-nanodeeltjes. Een paar combinaties vertoonden een lichte toename in knobbeltjesvorming (maar niet statistisch significant) bij hogere concentraties kinetine en/of ijzeroxide-nanodeeltjes, zoals de combinatie van 2,4-D (0,5–2 mg/L) met kinetine (1–1,5 mg/L) en ijzeroxide-nanodeeltjes (2–4 mg/L). Deze resultaten worden weergegeven in Figuur 2. Zwarte knobbeltjes vertegenwoordigen hypericine-rijke klieren, die zowel van nature voorkomen als gunstig zijn. In deze studie werden zwarte knobbeltjes voornamelijk geassocieerd met bruinverkleuring van weefsels, wat wijst op een gunstige omgeving voor hypericine-accumulatie. Behandeling met 2,4-D, kinetine en Fe₃O₄-nanodeeltjes bevorderde de callusgroei, verminderde bruinverkleuring en verhoogde het chlorofylgehalte, wat suggereert dat de metabolische functie verbeterd is en oxidatieve schade mogelijk verminderd wordt [37]. Deze studie evalueerde de effecten van kinetine in combinatie met 2,4-D en Fe₃O₄-nanodeeltjes op de groei en ontwikkeling van sint-janskruidcallus (Fig. 3a–g). Eerdere studies hebben aangetoond dat Fe₃O₄-nanodeeltjes schimmelwerende en antimicrobiële eigenschappen bezitten [38, 39] en dat ze, in combinatie met plantengroeiregulatoren, de afweermechanismen van planten kunnen stimuleren en cellulaire stressindicatoren kunnen verlagen [18]. Hoewel de biosynthese van secundaire metabolieten genetisch gereguleerd is, is de werkelijke opbrengst ervan sterk afhankelijk van de omgevingsomstandigheden. Metabolische en morfologische veranderingen kunnen de niveaus van secundaire metabolieten beïnvloeden door de expressie van specifieke plantengenen te reguleren en te reageren op omgevingsfactoren. Bovendien kunnen inductoren de activering van nieuwe genen teweegbrengen, die op hun beurt de enzymatische activiteit stimuleren, waardoor uiteindelijk meerdere biosynthetische routes worden geactiveerd en de vorming van secundaire metabolieten wordt bevorderd. Een andere studie toonde bovendien aan dat het verminderen van schaduw de blootstelling aan zonlicht vergroot, waardoor de dagtemperaturen in de natuurlijke habitat van *Hypericum perforatum* stijgen, wat ook bijdraagt aan een verhoogde hypericine-opbrengst. Op basis van deze gegevens onderzocht deze studie de rol van ijzeren nanodeeltjes als potentiële inductoren in weefselkweek. De resultaten toonden aan dat deze nanodeeltjes genen die betrokken zijn bij de hesperidinebiosynthese kunnen activeren door enzymatische stimulatie, wat leidt tot een verhoogde accumulatie van deze verbinding (Fig. 2). Vergeleken met planten die onder natuurlijke omstandigheden groeien, kan daarom worden gesteld dat de productie van dergelijke verbindingen in vivo ook kan worden verhoogd wanneer matige stress wordt gecombineerd met de activering van genen die betrokken zijn bij de biosynthese van secundaire metabolieten. Combinatietherapieën hebben over het algemeen een positief effect op de regeneratiesnelheid, maar in sommige gevallen is dit effect verzwakt. Opvallend is dat behandeling met 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinase en verschillende concentraties de regeneratiesnelheid onafhankelijk en significant met 50,85% konden verhogen in vergelijking met de controlegroep (Fig. 4c). Deze resultaten suggereren dat specifieke combinaties van nanohormonen synergetisch kunnen werken om plantengroei en metabolietenproductie te bevorderen, wat van groot belang is voor weefselkweek van medicinale planten. Palmer en Keller [50] toonden aan dat behandeling met 2,4-D onafhankelijk callusvorming in St. perforatum kon induceren, terwijl de toevoeging van kinase de callusvorming en regeneratie significant verbeterde. Dit effect was te danken aan de verbetering van de hormonale balans en de stimulatie van celdeling. Bal et al. [51] ontdekten dat behandeling met Fe₃O₄-NP onafhankelijk de functie van antioxidatieve enzymen kon verbeteren, waardoor de wortelgroei in St. perforatum werd bevorderd. Kweekmedia die Fe₃O₄-nanodeeltjes bevatten in concentraties van 0,5 mg/L, 1 mg/L en 1,5 mg/L verbeterden de regeneratiesnelheid van vlasplanten [52]. Het gebruik van kinetine, 2,4-dichloorbenzothiazolinon en Fe₃O₄-nanodeeltjes verbeterde de callus- en wortelvormingssnelheid aanzienlijk. De mogelijke bijwerkingen van het gebruik van deze hormonen voor in vitro-regeneratie moeten echter in overweging worden genomen. Zo kan langdurig of hooggeconcentreerd gebruik van 2,4-dichloorbenzothiazolinon of kinetine leiden tot somatische klonale variatie, oxidatieve stress, abnormale callusmorfologie of verglaasde groei. Een hoge regeneratiesnelheid voorspelt daarom niet noodzakelijkerwijs genetische stabiliteit. Alle geregenereerde planten moeten worden beoordeeld met behulp van moleculaire merkers (bijv. RAPD, ISSR, AFLP) of cytogenetische analyse om hun homogeniteit en gelijkenis met in vivo-planten te bepalen [53,54,55].
Deze studie toonde voor het eerst aan dat het gecombineerde gebruik van plantengroeiregulatoren (2,4-D en kinetine) met Fe₃O₄-nanodeeltjes de morfogenese en de accumulatie van belangrijke bioactieve metabolieten (waaronder hypericine en hyperoside) in *Hypericum perforatum* kan verbeteren. Het geoptimaliseerde behandelingsschema (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetine + 4 mg/L Fe₃O₄-nanodeeltjes) maximaliseerde niet alleen de callusvorming, organogenese en de opbrengst aan secundaire metabolieten, maar vertoonde ook een mild inducerend effect, wat mogelijk de stresstolerantie en de medicinale waarde van de plant verbetert. De combinatie van nanotechnologie en plantenweefselkweek biedt een duurzaam en efficiënt platform voor grootschalige in vitro-productie van medicinale stoffen. Deze resultaten effenen de weg voor industriële toepassingen en toekomstig onderzoek naar moleculaire mechanismen, doseringsoptimalisatie en genetische precisie, en verbinden daarmee fundamenteel onderzoek naar medicinale planten met praktische biotechnologie.
Geplaatst op: 12 december 2025