Het anthelmintische geneesmiddel N,N-diethyl-m-toluamide (DEETEr is gerapporteerd dat DEET AChE (acetylcholinesterase) remt en mogelijk kankerverwekkende eigenschappen heeft als gevolg van overmatige vascularisatie. In dit artikel tonen we aan dat DEET specifiek endotheelcellen stimuleert die angiogenese bevorderen, waardoor de tumorgroei toeneemt. DEET activeert cellulaire processen die leiden tot angiogenese, waaronder proliferatie, migratie en adhesie. Dit gaat gepaard met een verhoogde NO-productie en VEGF-expressie in endotheelcellen. Het uitschakelen van M3 of het gebruik van farmacologische M3-remmers maakte al deze effecten ongedaan, wat suggereert dat DEET-geïnduceerde angiogenese M3-gevoelig is. Experimenten met calciumsignalering in endotheelcellen en HEK-cellen die M3-receptoren overexpressen, evenals bindings- en dockingstudies, geven aan dat DEET fungeert als een allosterische modulator van M3-receptoren. Bovendien remt DEET AChE, waardoor de biologische beschikbaarheid van acetylcholine en de binding ervan aan M3-receptoren toeneemt en de pro-angiogene effecten via allosterische regulatie worden versterkt.
Primaire EC's werden geïsoleerd uit de aorta van Zwitserse muizen. De extractiemethode werd aangepast van het Kobayashi-protocol 26. Murine EC's werden gekweekt in EBM-2-medium aangevuld met 5% warmte-geïnactiveerd FBS tot de vierde passage.
Het effect van twee concentraties DEET op de proliferatie van HUVEC-, U87MG- of BF16F10-cellen werd geanalyseerd met behulp van de CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kort gezegd werden 5 x 10³ cellen per putje in een 96-wells plaat gezaaid, een nacht laten hechten en vervolgens 24 uur behandeld met DEET. Na verwijdering van het kweekmedium werd aan elk putje van de microplaat een kleurstofbindende oplossing toegevoegd en werden de cellen 30 minuten bij 37 °C geïncubeerd. De fluorescentieniveaus werden bepaald met een Mithras LB940 multimode microplaatlezer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Duitsland) uitgerust met excitatiefilters van 485 nm en emissiefilters van 530 nm.
HUVEC-cellen werden uitgezaaid in 96-wells platen met een dichtheid van 104 cellen per well. De cellen werden gedurende 24 uur behandeld met DEET. De cellevensvatbaarheid werd bepaald met behulp van een colorimetrische MTT-assay (Sigma-Aldrich, M5655). De optische dichtheidswaarden werden verkregen met een multimode microplaatlezer (Mithras LB940) bij een golflengte van 570 nm.
De effecten van DEET werden onderzocht met behulp van in vitro angiogenese-assays. Behandeling met 10⁻⁸ M of 10⁻⁵ M DEET verhoogde de vorming van capillaire lengte in HUVEC's (Fig. 1a, b, witte balken). Vergeleken met de controlegroep liet behandeling met DEET-concentraties variërend van 10⁻¹⁴ tot 10⁻⁵ M zien dat de capillaire lengte een plateau bereikte bij 10⁻⁸ M DEET (Aanvullende Fig. S2). Er werd geen significant verschil gevonden in het in vitro pro-angiogene effect van HUVEC's behandeld met DEET in het concentratiebereik van 10⁻⁸ M en 10⁻⁵ M.
Om het effect van DEET op neovascularisatie te bepalen, hebben we in vivo neovascularisatiestudies uitgevoerd. Na 14 dagen vertoonden muizen die waren geïnjecteerd met endotheelcellen die vooraf waren gekweekt met 10-8 M of 10-5 M DEET een significante toename van het hemoglobinegehalte (Fig. 1c, witte balken).
Verder werd DEET-geïnduceerde neovascularisatie bestudeerd bij muizen met U87MG-xenografts die dagelijks (intraperitoneaal) werden geïnjecteerd met DEET in een dosis waarvan bekend is dat deze plasmaconcentraties van 10⁻⁵ M induceert, wat normaal is bij blootgestelde mensen. 23. Detecteerbare tumoren (d.w.z. tumoren >100 mm³) werden waargenomen 14 dagen na injectie van U87MG-cellen in de muizen. Op dag 28 was de tumorgroei significant toegenomen bij de met DEET behandelde muizen in vergelijking met de controlegroep (Fig. 1d, vierkanten). Bovendien toonde CD31-kleuring van de tumoren aan dat DEET het capillaire oppervlak significant verhoogde, maar niet de microvaatdichtheid (Fig. 1e-g).
Om de rol van muscarine-receptoren bij DETA-geïnduceerde proliferatie te bepalen, werd 10-8 M of 10-5 M DETA gebruikt in aanwezigheid van pFHHSiD (10-7 M, een selectieve M3-receptorantagonist). Behandeling van HUVEC. pFHHSiD blokkeerde de proliferatieve eigenschappen van DETA volledig bij alle concentraties (Tabel 1).
Onder deze omstandigheden onderzochten we ook of DEET de capillaire lengte in HUVEC-cellen zou vergroten. Op vergelijkbare wijze voorkwam pFHHSiD de door DEET geïnduceerde capillaire lengtegroei significant (Fig. 1a, b, grijze balken). Verder werden soortgelijke experimenten uitgevoerd met M3 siRNA. Hoewel de controle-siRNA niet effectief was in het bevorderen van capillaire vorming, maakte het uitschakelen van de M3-muscarinereceptor een einde aan het vermogen van DEET om de capillaire lengte te vergroten (Fig. 1a, b, zwarte balken).
Bovendien werden zowel de door 10-8 M als door 10-5 M DEET geïnduceerde vascularisatie in vitro en de neovascularisatie in vivo volledig geblokkeerd door pFHHSiD (Fig. 1c, d, cirkels). Deze resultaten geven aan dat DEET angiogenese bevordert via een route die gevoelig is voor selectieve M3-receptorantagonisten of M3 siRNA.
AChE is het moleculaire doelwit van DEET. Geneesmiddelen zoals donepezil, die als AChE-remmers werken, kunnen EC-angiogenese in vitro en in muizenmodellen met ischemie in de achterpoten stimuleren14. We hebben het effect van twee concentraties DEET op de AChE-enzymactiviteit in HUVEC getest. Lage (10⁻⁸ M) en hoge (10⁻⁵ M) concentraties DEET verlaagden de endotheel-AChE-activiteit in vergelijking met de controlecondities (Fig. 2).
Beide concentraties DEET (10⁻⁸ M en 10⁻⁵ M) verminderden de acetylcholinesterase-activiteit op HUVEC. BW284c51 (10⁻⁵ M) werd gebruikt als controle voor acetylcholinesterase-remmers. De resultaten worden weergegeven als percentage van de AChE-activiteit op HUVEC behandeld met de twee concentraties DEET, vergeleken met cellen behandeld met het vehikel. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van zes onafhankelijke experimenten. *p < 0,05 vergeleken met de controle (Kruskal-Wallis en Dunn meervoudige vergelijkingstest).
Stikstofmonoxide (NO) is betrokken bij het angiogenetische proces 33, daarom werd de NO-productie in DEET-gestimuleerde HUVEC's onderzocht. De NO-productie in endotheelcellen behandeld met DEET was verhoogd in vergelijking met controlecellen, maar bereikte pas significantie bij een dosis van 10-8 M (Fig. 3c). Om de moleculaire veranderingen te bepalen die de DEET-geïnduceerde NO-productie reguleren, werden de eNOS-expressie en -activering geanalyseerd met behulp van Western blotting. Hoewel DEET-behandeling de eNOS-expressie niet veranderde, verhoogde het de eNOS-fosforylering op de activerende plaats (Ser-1177) significant, terwijl de fosforylering op de remmende plaats (Thr-495) afnam in vergelijking met onbehandelde cellen (Fig. 3d). Bovendien werd de verhouding van gefosforyleerde eNOS op de activerende en remmende plaats berekend na normalisatie van de hoeveelheid gefosforyleerde eNOS ten opzichte van de totale hoeveelheid enzym. Deze verhouding was significant verhoogd in HUVEC's die met elke concentratie DEET waren behandeld, vergeleken met onbehandelde cellen (Fig. 3d).
Ten slotte werd de expressie van VEGF, een van de belangrijkste pro-angiogene factoren, geanalyseerd met behulp van Western blotting. DEET verhoogde de VEGF-expressie significant, terwijl pFHHSiD deze expressie volledig blokkeerde.
Omdat de effecten van DEET gevoelig zijn voor zowel farmacologische blokkade als downregulatie van M3-receptoren, hebben we de hypothese getest dat DEET de calciumsignalering zou kunnen versterken. Verrassend genoeg bleek DEET de cytoplasmatische calciumconcentratie in HUVEC (gegevens niet getoond) en HEK/M3 (Fig. 4a, b) niet te verhogen bij beide gebruikte concentraties.
Geplaatst op: 30 december 2024