Het ontwormingsmiddel N,N-diethyl-m-toluamide (DEET) is gerapporteerd AChE (acetylcholinesterase) te remmen en heeft potentieel carcinogene eigenschappen vanwege overmatige vascularisatie. In dit artikel laten we zien dat DEET specifiek endotheelcellen stimuleert die angiogenese bevorderen, waardoor tumorgroei wordt bevorderd. DEET activeert cellulaire processen die leiden tot angiogenese, waaronder proliferatie, migratie en adhesie. Dit wordt geassocieerd met een verhoogde NO-productie en VEGF-expressie in endotheelcellen. Het uitschakelen van M3 of het gebruik van farmacologische M3-remmers deed al deze effecten teniet, wat suggereert dat DEET-geïnduceerde angiogenese M3-gevoelig is. Experimenten met calciumsignalering in endotheel- en HEK-cellen die M3-receptoren tot overexpressie brengen, evenals bindings- en dockingstudies, geven aan dat DEET werkt als een allosterische modulator van M3-receptoren. Bovendien remt DEET AChE, waardoor de biologische beschikbaarheid van acetylcholine en de binding ervan aan M3-receptoren toeneemt, en proangiogene effecten worden versterkt door allosterische regulatie.
Primaire EC's werden geïsoleerd uit de aorta van Zwitserse muizen. De extractiemethode was gebaseerd op het Kobayashi-protocol 26 . Muizen-EC's werden gekweekt in EBM-2-medium aangevuld met 5% hitte-geïnactiveerde FBS tot de vierde passage.
Het effect van twee concentraties DEET op de proliferatie van HUVEC, U87MG of BF16F10 werd geanalyseerd met de CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). Kort gezegd werden 5103 cellen per well gezaaid in een 96-wells plaat, een nacht laten hechten en vervolgens 24 uur behandeld met DEET. Na verwijdering van het groeimedium werd kleurstofbindende oplossing toegevoegd aan elke well van de microtiterplaat en werden de cellen 30 minuten geïncubeerd bij 37 °C. De fluorescentieniveaus werden bepaald met een Mithras LB940 multimode microtiterplaatlezer (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Duitsland), uitgerust met 485 nm excitatiefilters en 530 nm emissiefilters.
HUVEC werd gezaaid in 96-wells platen met een dichtheid van 104 cellen per well. De cellen werden 24 uur behandeld met DEET. De celviabiliteit werd beoordeeld met een colorimetrische MTT-test (Sigma-Aldrich, M5655). Optische dichtheidswaarden werden verkregen met een multimode microtiterplaatlezer (Mithras LB940) bij een golflengte van 570 nm.
De effecten van DEET werden bestudeerd met behulp van in-vitro-angiogenese-assays. Behandeling met 10-8 M of 10-5 M DEET verhoogde de vorming van capillaire lengte in HUVEC's (Fig. 1a, b, witte balken). Vergeleken met de controlegroep toonde behandeling met DEET-concentraties variërend van 10-14 tot 10-5 M aan dat de capillaire lengte een plateau bereikte bij 10-8 M DEET (Aanvullende figuur S2). Er werd geen significant verschil gevonden in het in-vitro proangiogene effect van HUVEC's behandeld met DEET in het concentratiebereik van 10-8 M en 10-5 M.
Om het effect van DEET op neovascularisatie te bepalen, voerden we in-vivo neovascularisatiestudies uit. Na 14 dagen vertoonden muizen die waren geïnjecteerd met endotheelcellen die waren voorgekweekt met 10-8 M of 10-5 M DEET een significante toename van het hemoglobinegehalte (Fig. 1c, witte balken).
Bovendien werd DEET-geïnduceerde neovascularisatie bestudeerd bij muizen met een U87MG-xenotransplantaat die dagelijks (ip) werden geïnjecteerd met DEET in een dosis waarvan bekend is dat deze plasmaconcentraties van 10-5 M induceert, wat normaal is bij blootgestelde mensen. in 23. Detecteerbare tumoren (d.w.z. tumoren > 100 mm³) werden 14 dagen na injectie van U87MG-cellen in muizen waargenomen. Op dag 28 was de tumorgroei significant toegenomen bij met DEET behandelde muizen vergeleken met muizen in de controlegroep (Figuur 1d, vierkanten). Bovendien toonde CD31-kleuring van tumoren aan dat DEET de capillaire oppervlakte significant verhoogde, maar niet de dichtheid van de microvaten (Figuur 1e-g).
Om de rol van muscarinereceptoren bij DETA-geïnduceerde proliferatie te bepalen, werd 10-8 M of 10-5 M DETA in aanwezigheid van pFHHSiD (10-7 M, een selectieve M3-receptorantagonist) gebruikt. Behandeling met HUVEC blokkeerde de proliferatieve eigenschappen van DETA volledig in alle concentraties (tabel 1).
Onder deze omstandigheden onderzochten we ook of DEET de capillaire lengte in HUVEC-cellen zou vergroten. pFHHSiD voorkwam eveneens significant de door DEET geïnduceerde capillaire lengte (Fig. 1a, b, grijze balken). Verder werden vergelijkbare experimenten uitgevoerd met M3-siRNA. Hoewel het controle-siRNA niet effectief was in het bevorderen van de capillaire vorming, deed het uitschakelen van de M3-muscarinereceptor het vermogen van DEET om de capillaire lengte te vergroten teniet (Fig. 1a, b, zwarte balken).
Bovendien werden zowel de door 10-8 M of 10-5 M DEET geïnduceerde vascularisatie in vitro als de neovascularisatie in vivo volledig geblokkeerd door pFHHSiD (Fig. 1c, d, cirkels). Deze resultaten wijzen erop dat DEET de angiogenese bevordert via een route die gevoelig is voor selectieve M3-receptorantagonisten of M3-siRNA.
AChE is het moleculaire doelwit van DEET. Geneesmiddelen zoals donepezil, die werken als AChE-remmers, kunnen de angiogenese van EC stimuleren in vitro en in muizenmodellen met ischemie in de achterpoten14. We testten het effect van twee DEET-concentraties op de AChE-enzymactiviteit in HUVEC. Lage (10-8 M) en hoge (10-5 M) DEET-concentraties verlaagden de endotheliale AChE-activiteit in vergelijking met de controlegroep (fig. 2).
Beide concentraties DEET (10-8 M en 10-5 M) verminderden de acetylcholinesteraseactiviteit op HUVEC. BW284c51 (10-5 M) werd gebruikt als controle voor acetylcholinesteraseremmers. De resultaten worden weergegeven als percentage AChE-activiteit op HUVEC behandeld met de twee concentraties DEET in vergelijking met cellen behandeld met een dragerstof. De waarden worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van zes onafhankelijke experimenten. *p < 0,05 vergeleken met de controle (meervoudige vergelijkingstest van Kruskal-Wallis en Dunn).
Stikstofmonoxide (NO) is betrokken bij het angiogene proces 33, daarom werd de NO-productie in DEET-gestimuleerde HUVEC's bestudeerd. De endotheliale NO-productie die met DEET werd behandeld, was verhoogd vergeleken met controlecellen, maar bereikte pas significantie bij een dosis van 10-8 M (Fig. 3c). Om de moleculaire veranderingen te bepalen die de DEET-geïnduceerde NO-productie controleren, werden de eNOS-expressie en -activering geanalyseerd met behulp van Western blotting. Hoewel DEET-behandeling de eNOS-expressie niet veranderde, verhoogde het de eNOS-fosforylering op de activerende plaats (Ser-1177) significant, terwijl de remmende plaats (Thr-495) afnam in vergelijking met onbehandelde cellen in eNOS-fosforylering (Fig. 3d). Bovendien werd de verhouding van gefosforyleerd eNOS op de activeringsplaats en de remmende plaats berekend na normalisatie van de hoeveelheid gefosforyleerd eNOS ten opzichte van de totale hoeveelheid enzym. Deze verhouding was significant hoger bij HUVEC's die met elke concentratie DEET waren behandeld, vergeleken met onbehandelde cellen (Figuur 3d).
Ten slotte werd de expressie van VEGF, een van de belangrijkste proangiogene factoren, geanalyseerd met behulp van Western blotting. DEET verhoogde de VEGF-expressie significant, terwijl pFHHSiD deze expressie volledig blokkeerde.
Omdat de effecten van DEET gevoelig zijn voor zowel farmacologische blokkade als downregulatie van M3-receptoren, hebben we de hypothese getest dat DEET de calciumsignalering zou kunnen versterken. Verrassend genoeg slaagde DEET er niet in om het cytoplasmatisch calcium te verhogen in HUVEC (gegevens niet getoond) en HEK/M3 (Fig. 4a, b) voor beide gebruikte concentraties.
Plaatsingstijd: 30-12-2024