Pesticiden spelen een cruciale rol bij het aanpakken van wereldwijde voedseltekorten en het bestrijden van door vectoren overgedragen ziekten bij de mens. Het groeiende probleem van resistentie tegen pesticiden vereist echter dringend de ontdekking van nieuwe verbindingen die zich richten op onderbenutte doelwitten. Insecten-TRPV-kanalen (transient receptor potential) – Nanzhong (Nan) en inactief (Iav) – kunnen heterologe kanalen (Nan-Iav) vormen en zich lokaliseren in mechanosensorische organen die geotropisme, gehoor en proprioceptie bij insecten reguleren. Sommige pesticiden, zoals aphidopyrrolidon (AP), richten zich op Nan-Iav via onbekende mechanismen. AP is effectief tegen zuigende insecten (Hemvleugeligen), omdat het de voeding verhindert door de functie van de filamenten te verstoren. AP kan alleen binden aan Nan, maar alleen Nan-Iav kan interageren met agonisten, waaronder endogeen nicotinamide (NAM), en vertoont daardoor kanaalactiviteit. Ondanks het potentieel van Nan-Iav als doelwit voor insecticiden, is er weinig bekend over de kanaalassemblage, regulerende bindingsplaatsen en Ca2+-afhankelijke regulatie ervan, wat de verdere ontwikkeling van insecticiden belemmert. In deze studie werd cryo-elektronenmicroscopie gebruikt om de structuur van Nan-Iav in Hemiptera-insecten te bepalen in de calmodulin-ligandvrije toestand, evenals met AP en NAM aan de grens van het ankyrine-repeat cytoplasmatisch domein (ARD). Verrassend genoeg ontdekten we dat het Nan-eiwit zelf een pentameer kan vormen, dat wordt gestabiliseerd door AP-gemedieerde ARD-interacties. Deze studie onthult moleculaire interacties tussen insecticiden en agonisten en Nan-Iav, benadrukt het belang van ARD voor de kanaalfunctie en -assemblage en onderzoekt het mechanisme van Ca2+-regulatie.
Tegen de achtergrond van de steeds ernstiger wordende wereldwijde klimaatverandering is de verslechterende voedselzekerheid wereldwijd een van de grootste uitdagingen van de 21e eeuw, met verstrekkende gevolgen voor de samenleving.1,2Het rapport 'State of Food Security and Nutrition in the World 2023' (SOFI) van de Wereldgezondheidsorganisatie schat dat wereldwijd ongeveer 2,33 miljard mensen te maken hebben met matige tot ernstige voedselonzekerheid, een probleem dat al lange tijd bestaat.3,4Helaas gaat naar schatting 20% tot 30% of meer van de oogst jaarlijks verloren door plagen en ziekteverwekkers, en de opwarming van de aarde zal naar verwachting de resistentie van plagen en de kwetsbaarheid van gewassen verergeren.4,5,6,7,8De ontwikkeling van pesticiden is cruciaal, niet alleen om gewassen te beschermen tegen plagen en de verspreiding van door vectoren overgedragen ziekteverwekkers te verminderen, maar ook om door vectoren overgedragen menselijke ziekten zoals dengue, malaria en de ziekte van Chagas te bestrijden, die steeds resistenter worden tegen pesticiden.5,9,10,11
Een van de belangrijkste doelwitten van neurotoxische insecticiden is het heterotetramere TRPV-kanaal Nanchung (Nan)-Inactive (Iav). Dit kanaal vertegenwoordigt een klasse van insecticide-doelwitten die pas in het afgelopen decennium zijn ontdekt, waaronder commercieel verkrijgbare insecticiden zoals imidacloprid en pyraclostrobin.12, 13, 14Het semisynthetische insecticide aphidopyrrolifen (AP) is een recent ontwikkeld en op de markt gebracht product waarvan het belangrijkste bestanddeel het actieve insecticide Inscalis® is, dat AP bindt op een subnanomolaire activiteitsconcentratie.15AP vertoont een lage acute toxiciteit voor bestuivers, nuttige insecten en andere niet-doelorganismen, en kan bij gebruik volgens de aanwijzingen op het etiket de resistentiedruk tegen andere insecticiden verminderen.16, 17, 18Nan en Iav komen wijdverspreid voor bij insectensoorten, worden alleen samen tot expressie gebracht in de chordale rekreceptorneuronen van de antennes en ledematen, en zijn cruciaal voor gehoor, zwaartekrachtperceptie en proprioceptie.13,16,19,20,21,22AP, imidacloprid en pyraclostrobin stimuleren het Nan-Iav-complex via een uniek mechanisme, waardoor uiteindelijk de proprioceptieve signaaloverdracht wordt geremd.13,16,23Bij zuigende insecten (hemiptera) zoals bladluizen en wittevliegen, leidt verlies van proprioceptie tot een verminderd vermogen om te eten, wat uiteindelijk de dood tot gevolg heeft.13,24Opvallend is dat AP een hoge affiniteit heeft voor het Nan-Iav-complex en een lage affiniteit voor Nan alleen. Binding van AP aan Nan-Iav induceert een elektrische stroom, maar binding aan Nan alleen stimuleert geen kanaalactiviteit. Iav zelf bindt helemaal niet aan AP.16Dit suggereert dat Nan en Iav mogelijk aan elkaar binden om verschillende Nan-Iav-kanaalcomplexen te vormen (bijvoorbeeld met verschillende stoichiometrische verhoudingen of verschillende arrangementen binnen dezelfde stoichiometrische verhouding) of dat AP aan meerdere bindingsplaatsen kan binden. Bovendien bindt de natuurlijke agonist nicotinamide (NAM) aan Drosophila Nan-Iav met een micromolaire affiniteit en vertoont het in vitro effecten die vergelijkbaar zijn met die van bladluizen (AP).16,25en het remmen van de voortplanting en het voeden van bladluizen, wat uiteindelijk tot hun dood leidt.25,26Deze gegevens roepen veel vragen op. Zo is het bijvoorbeeld nog onduidelijk hoe het Nan-Iav-heterodimeer wordt gevormd, welke bindingsplaatsen worden gebruikt om kleine moleculen te moduleren en hoe deze kleine moleculen de kanaalfunctie reguleren door proprioceptie te onderdrukken. Bovendien is het onduidelijk waarom Nan zelf inactief is en een lage affiniteit heeft voor AP, terwijl het Nan-Iav-heterodimeer actief is en AP met een hogere affiniteit bindt. Ten slotte is er weinig bekend over de Ca2+-afhankelijke regulatie van de Nan-Iav-functie en hoe deze is geïntegreerd in neuronale signaalprocessen.13,21
In deze studie hebben we, door cryo-elektronenmicroscopie, elektrofysiologie en radioligandbindingstechnieken te combineren, de assemblage van Nan-Iav en het mechanisme van de binding ervan aan kleine moleculaire regulatoren opgehelderd. Bovendien hebben we constitutief gebonden calmodulin (CaM) aan Iav en AP-gestabiliseerde Nan-pentameren gedetecteerd. Deze resultaten bieden belangrijk inzicht in de regulatie van calciumionen in kanalen, kanaalassemblage en de factoren die de ligandbindingsaffiniteit bepalen. Belangrijker nog, we hebben bevestigd dat ARD een centrale rol speelt in deze processen. Onze studie van complete insectenkanalen gebonden aan relevante landbouwbestrijdingsmiddelen27, 28, 29Dit biedt perspectieven voor de ontwikkeling van de pesticidenindustrie, verbetert de werkzaamheid en specificiteit van pesticiden en maakt de toepassing van op TRPV gerichte verbindingen op andere soorten mogelijk om de wereldwijde voedselzekerheid en de verspreiding van door vectoren overgedragen ziekten aan te pakken.
We ontdekten ook dat Nan-Iav wordt gereguleerd door Ca2+, en dat het regulatiemechanisme wordt gemedieerd door constitutief gebonden CaM. Belangrijk is dat deze Ca2+-afhankelijke regulatie van Nav door CaM significant verschilt van de regulatiemechanismen van andere ionkanalen (bijvoorbeeld spanningsafhankelijke Na+-kanalen en TRPV5/6-kanalen).52,53,54,55,56,57In het Nav1.2-kanaal bindt het C-terminale domein van CaM zich in een helixstructuur aan het C-terminale domein (CTD), en Ca2+ induceert de binding van het N-terminale domein aan het distale deel van het CTD.56In het TRPV5/6-kanaal bindt het C-terminale domein van CaM aan CTH, en Ca2+ induceert een opwaartse uitbreiding van het N-terminale domein ervan in de porie, waardoor de permeabiliteit voor kationen wordt geblokkeerd.53,54We stellen een model voor voor de Ca2+-gereguleerde functie van Nan-Iav-CaM (Fig. 4h). In dit model bindt het N-terminale domein van CaM constitutief aan het C-terminale domein (CTH) van Iav. In de rusttoestand (lage [Ca2+]-concentratie) interageert het C-terminale domein van CaM met Nan, waardoor de ARD-conformatie wordt gestabiliseerd en de kanaalopening wordt bevorderd. Binding van een agonist/insecticide aan het kanaal induceert porieopening, wat leidt tot Ca2+-influx. Ca2+ bindt vervolgens aan CaM, waardoor het C-terminale domein loskomt van de ARD van Nan. Omdat het blokkeren van de CaM-binding het remmende effect van Ca2+ vrijwel volledig opheft, moduleert deze loskoppeling de ARD-mobiliteit, waardoor Ca2+-afhankelijke inhibitie of desensitisatie optreedt. Het snelle herstel van de kanaalstromen na elutie van calciumionen (Fig. 4g) suggereert dat dit mechanisme snelle reacties op Ca2+-gemedieerde neuronale signalen mogelijk maakt. Bovendien is gebleken dat het C-terminale gebied van Iav, dat nog steeds slecht begrepen wordt, andere rollen speelt bij de kanaaltargeting en stroomregulatie.21
Tot slot presenteert onze studie de structuur met hoge resolutie van een insecticide-insecticide TRP-kanaalcomplex van agrarisch belang – een ontdekking die ons voorheen onbekend was. Opvallend is dat we de structuur en functie van het insectenkanaal hebben gekarakteriseerd in menselijke cellen (HEK293S GnTi–) in plaats van in insectencellen. Gezien de toenemende insecticideresistentie en de aanhoudende druk op de voedselzekerheid en de bestrijding van ziekteverwekkers, biedt ons werk belangrijke informatie die de ontwikkeling van nieuwe insecticiden ten behoeve van de menselijke gezondheid en de wereldwijde voedselzekerheid zal bevorderen. Studies hebben aangetoond dat insecticiden zoals AP effectief zijn tegen sommige plagen wanneer ze volgens de gebruiksaanwijzing worden gebruikt en een lage acute toxiciteit hebben voor nuttige bestuivers, wat hun milieuvriendelijkheid aantoont.13,16Bovendien is gebleken dat tests met sommige AP-derivaten op muggen uiteindelijk hun vliegvermogen verliezen. Inzicht in hoe deze modulerende verbindingen zich binden aan Nan-Iav zal de modificatie van bestaande verbindingen of de ontwikkeling van nieuwe verbindingen voor effectievere ennauwkeurigOngediertebestrijding. Ons onderzoek toont aan dat de Nan-Iav ARD-interface cruciaal is, niet alleen voor het reguleren van de activiteit van endogene verbindingen, pesticiden en Ca2+-CaM, maar ook voor de kanaalassemblage. We suggereren dat het verstoren van de heterodimeerassemblage met kleine moleculen een unieke en veelbelovende aanpak kan zijn voor de ontwikkeling van ionkanaalremmers.
Van de acht orthologe genen werden de volledige genen van de bruine kever (Halyomorpha halys) Nanchung en Inactive geselecteerd, die een uitstekende stabiliteit in detergenten vertoonden. De gesynthetiseerde genen werden codon-geoptimaliseerd voor expressie bij de mens en gekloneerd in de pBacMam pCMV-DEST-vector (Life Technologies) met behulp van de restrictie-enzymen XhoI en EcoRI. Dit zorgde ervoor dat de klonen in frame waren met de C-terminale GFP-FLAG-10xHis- en mCherry-FLAG-10xHis-tags, die worden afgesplitst door HRC-3C-protease (PPX), waardoor onafhankelijke expressie mogelijk is.uitdrukkingDe primers die gebruikt werden om Nanchung en Inactive in de pBacMam-vector te klonen, waren als volgt:
Microscopische beelden van individuele deeltjes werden verkregen met een Titan Krios G2 transmissie-elektronenmicroscoop (FEI) uitgerust met een K3-camera en een Gatan BioQuantum-energiefilter. De microscoop werd bediend met een energie van 300 keV, een energie-instelling van 20 eV, een pixelgrootte van 1,08 Å/pixel (nominale vergroting van 81.000x) en een defocusgradiënt variërend van -0,8 tot -2,2 μm. Video-opnamen werden gemaakt met 40 beelden per seconde met behulp van een Latitude S-microscoop (Gatan) met een nominale dosisrate van 25 e–px−1 s−1, een belichtingstijd van 2,4 s en een totale dosis van ongeveer 60 e–Å−2.
Beam-geïnduceerde bewegingscorrectie en dosisweging werden uitgevoerd op film met behulp van MotionCor2 in RELION 4.061. De parameterschatting van de contrastoverdrachtsfunctie (CTF) werd uitgevoerd in cryoSPARC met behulp van de patch-gebaseerde CTF-schattingsmethode62. Microfoto's met een CTF-aanpassingsresolutie ≥4 Å werden uitgesloten van verdere analyse. Doorgaans werd een subset van 500-1000 microfoto's gebruikt voor puntselectie in cryoSPARC, gevolgd door verschillende rondes van 2D-classificatie na filtering om een duidelijk referentiebeeld te verkrijgen voor sjabloongebaseerde deeltjesselectie. Deeltjes werden vervolgens geëxtraheerd met behulp van begrenzingskaders van 64 pixels en 4-voudige binning. Verschillende rondes van 2D-classificatie werden uitgevoerd om ongewenste deeltjescategorieën te verwijderen. Het initiële 3D-model werd gereconstrueerd met behulp van ab initio-reconstructie en verfijnd met behulp van niet-uniforme verfijning in cryoSPARC. 3D-classificatie werd uitgevoerd in cryoSPARC of RELION op basis van ARD-heterogeniteit. Er werd geen significante heterogeniteit van membraandomeinen waargenomen. De deeltjes werden verfijnd met behulp van de C1- en C2-methoden; deeltjes met een hogere C2-resolutie werden als symmetrisch beschouwd ten opzichte van C2 en geïmporteerd in RELION voor Bayesiaanse verfijning. De deeltjes werden vervolgens teruggebracht naar cryoSPARC voor de uiteindelijke niet-uniforme en lokale verfijning. De uiteindelijke resolutie en het aantal deeltjes worden weergegeven in Tabel 1.
Bij de verwerking van Nan+AP-pentameren hebben we verschillende methoden onderzocht om de resolutie van membraandomeinen (met name het poriegebied) te verbeteren, zoals signaalsubtractie en TMD-maskering. Deze pogingen bleken echter niet succesvol vanwege de potentieel extreme wanorde in het poriegebied en de algehele heterogeniteit van de TMD. De uiteindelijke resolutie werd berekend met behulp van een masker dat automatisch werd gegenereerd door de niet-uniforme verwerkingsmethode in cryoSPARC, voornamelijk gericht op het ARD-gebied. Dit resulteerde in een aanzienlijk hogere resolutie dan die van de membraandomeinen (met name het VSLD-gebied).
Initiële de novo-modellen van de apo-vormen van de Nanchung- en Inactive-bugs werden eerst gegenereerd met Coot63, en modellen van de Nan- en Iav-bugs werden gegenereerd met AlphaFold264 om gebieden met een lage betrouwbaarheid te identificeren. De modellering van calmoduline was gebaseerd op rigide-lichaam-aanpassingen van de Ca2+-bindende en Ca2+-vrije modellen in respectievelijk PDB-toegangsnummers 4JPZ56 en 1CFD65. De modellen werden verfijnd met behulp van sferische verfijning om de juiste stereochemie en goede geometrie te garanderen. Fosfatidylcholine, fosfatidylethanolamine en fosfatidylserine werden vervolgens gemodelleerd als goed gedefinieerde lipidedichtheden, en de NAM- en AP-liganden werden in de overeenkomstige dichtheden in de tight junctions geplaatst. Constraint-bestanden werden gegenereerd uit de SMILES-string van de isovormen met behulp van eLBOW in PHENIX66. Ten slotte werden de modellen in de reële ruimte verfijnd in PHENIX met behulp van lokale rasterzoeking en globale minimalisatie met secundaire structuurbeperkingen. De MolProbity-server werd gebruikt voor modelverfijning en structurele analyse, en illustraties werden gemaakt met PyMOL en UCSF Chimera X. 67,68,69 Apertuuranalyse werd uitgevoerd met de HOLE-server,70 en sequentieconservatiekartering werd uitgevoerd met de Consurf-server.71
Statistische analyses werden uitgevoerd met Igor Pro 6.2, Excel Office 365 en GraphPad Prism 7.0. Alle kwantitatieve gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardfout (SEM). De t-toets van Student (tweezijdig, ongepaard) werd gebruikt om twee groepen te vergelijken. Een eenzijdige variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de post-hoctoets van Dunnett, werd gebruikt om meerdere groepen te vergelijken. *P< 0,05, **P< 0,01, en ***PP-waarden < 0,001 werden als statistisch significant beschouwd, afhankelijk van de dataverdeling. De Kd- en Ki-waarden en hun asymmetrische 95%-betrouwbaarheidsintervallen werden berekend met GraphPad Prism 10.
Voor meer informatie over de onderzoeksmethodologie kunt u het Nature Portfolio Report Summary raadplegen, waarnaar in dit artikel wordt verwezen.
Het initiële model werd gebouwd met behulp van de calmodulin-modellen uit de PDB 4JPZ- en 1CFD-databases. De coördinaten zijn gedeponeerd in de Protein Data Bank (PDB) onder de toegangsnummers 9NVN (Nan-Iav-CaM zonder ligand), 9NVO (Nan-Iav-CaM gebonden aan nicotinamide), 9NVP (Nan-Iav-CaM gebonden aan nicotinamide en EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM gebonden aan aphenidolpyrrolline en calcium), 9NVR (Nan-Iav-CaM gebonden aan aphenidolpyrrolline en EDTA) en 9NVS (Nan-pentameer gebonden aan aphenidolpyrrolline). De corresponderende cryo-elektronenmicroscopiebeelden zijn gedeponeerd in de Electron Microscopy Database (EMDB) onder de volgende toegangsnummers: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM zonder ligand), EMD-49845 (Nan-Iav-CaM-complex met nicotinamide), EMD-49846 (Nan-Iav-CaM-complex met nicotinamide en EDTA), EMD-49847 (Nan-Iav-CaM-complex met aphidopyrrolline en calcium), EMD-49848 (Nan-Iav-CaM-complex met aphidopyrrolline en EDTA) en EMD-49849 (Nan-pentameercomplex met aphidopyrrolline). De ruwe data voor de functionele analyse worden in dit artikel gepresenteerd.
Geplaatst op: 28 januari 2026